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过氧化物酶活性测定方法 过氧化物酶活性的测定(比色法) 过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。 一、原理 在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在 470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量 470 nm 的吸光度变化测定过氧化物酶活性。 二、实验材料、试剂与仪器设备 (一)实验材料:马铃薯块茎。 (二)试剂 1 ( 100 mmol , L 磷酸缓冲液 pH7.0 (见附录)。磷酸氢二钠。。。。。磷酸二氢钠。。。。。 2 (反应混合液: 100 mmol , L 磷酸缓冲液( pH7.0 ) 50 mL 于烧杯中，加入愈创木酚((邻甲氧基苯酚) 28 μl ，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入 30 % 过氧化氢 19 μl ，混合均匀，保存于冰箱中。 (三)仪器设备 分光光度计，研钵，恒温水浴锅， 100 mL 容量瓶，吸管， 离心机。 三、实验步骤 1 (称取植物材料 1 g ，剪碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，以 4000 r , min 离心 10 min ，上清液转入 100 mL 容量瓶中，残渣再用 5 mL 磷酸缓冲液提取一次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，贮于低温下备用。 2 (取光径 1 cm 比色杯 2 只，于 1 只中加入反应混合液 3 mL 和磷酸缓冲液 1mL ，作为对照，另 1 只中加入反应混合液 3 mL 和上述酶液 1mL (如酶活性过高可稀释之)，立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量波长 470 nm 下吸光度值，每隔 1min 读数一次。 四、结果计算 以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 ΔA 470 /[min ? g (鲜重) ] 表示之。也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位( u )表示。 min ) ]= 过氧化物酶活性 [u/ ( g ? ΔA470为反应时间内吸光值的变化;W为所称样品重，g;t为反应时间，min;VT为提取酶液总体积，ml;VS为测定时取用酶液体积，ml。 配制1L 0.01mol/L ph7.0的磷酸盐缓冲溶液: 缓冲溶液pH计算公式: ^^^^^^^^^^^^^^^c(H2PO4^-) pH=pKa2-lg---------- ^^^^^^^^^^^^^^^c(HPO4^2-) 把pH=7.0和pKa2=7.2代入，得c(H2PO4^-)=1.585*c(HPO4^2-) 磷酸盐浓度为0.01mol/L，就是c(H2PO4^-)+c(HPO4^2-)=0.01 这样可解出缓冲溶液中两种离子的浓度。 c(HPO4^2-) = 0.0039 mol/L; c(H2PO4-) =0.0061 mol/L 计算: n(P) = 0.01*1 =0.01 mol m(NaH2PO4) = 0.01*120 =1.2g NaH2PO4 + NaOH = Na2HPO4 + H2O m(NaOH) = 0.0039*1*40 = 0.156g 称取无水NaH2PO4 1.2克， NaOH 0.156克，加水溶解，再稀释至1 L即可。