DB15T 1491-2018油菜籽(种子)中细菌性黑斑病菌检测方法.pdfVIP

ICS 65.020.01 B 16 备案号：60274-2019 DB 15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 1491—2018 油菜籽(种子)中细菌性黑斑病菌检测方法 Detection methods for Pseudomonas syringae pv. maculicola in Rapeseed(Seeds) 2018-09-30 发布 2018-12-30 实施 内蒙古自治区质量技术监督局 发布 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由二连浩特出入境检验检疫局技术中心提出。 本标准由内蒙古自治区质量技术监督局归口。 本标准起草单位：中华人民共和国二连浩特出入境检验检疫局技术中心、中华人民共和国南海出入 境检验检疫局技术中心、中华人民共和国满洲里出入境检验检疫局技术中心。 本标准主要起草人：袁淑珍、张永宏、张志峰、李凯兵、刘玮琦、魏宇虹、李菁雯。 油菜籽(种子)中细菌性黑斑病菌检测方法 1 范围 本标准规定了油菜籽(种子)中细菌性黑斑病菌的鉴定、检测结果判定等要求。 本标准适用于油菜籽(种子)中细菌性黑斑病菌的检测方法。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 细菌性黑斑病菌Bacterial black spot 学名: Pseudomonas syringae pv．Maculicola，简称PSM。 中文名:丁香假单胞杆菌斑生致病变种。 该病菌属于原核生物界Procaryotae，薄壁菌门Gracilicutes，假单胞菌科Pseudomonadaceae。 4 病菌的鉴定 4.1 PCR 初筛 4.1.1 样品DNA 提取 从油菜籽(种子)样品中取200 g用作检测样品。在样品中加入350 mL生理盐水，4 ℃浸泡过夜；纱 布过滤，滤液10000 r/min离心15 min，1 mL灭菌水悬浮沉淀，转入EP管12 000 r/min离心5 min，沉淀 用于提取DNA。用细菌DNA提取试剂盒提取DNA。重复3次。 4.1.2 PCR 检测 分别取2 µL样品DNA，检测hrpZ基因和冠毒素基因，分别进行PCR扩增。用十字花科黑斑病菌标准 菌株DNA作阳性对照，用灭菌蒸馏水作空白对照。 hrpZ基因检测引物MM5F(5-gaacgagctgaaggaagaca-3)//5R(5-cagcctggttagtctggtta-3) ，预期扩增产物 532 bp；冠毒素基因检测引物cfl F(5-ggcgctccctcgcactt-3)//R(5-ggtattggcgggggtgc-3)，预期扩增产物670 bp 。 PCR反应体系：PCR反应总体积为30 µL，包含：10 mmol/L Tris-HCl ；50 mmol/L KCl （pH 8.3 ）； 1.5 mmol/L MgCl2 ；dATP、dGTP 、dCTP 、dTTP浓度均为100 µmol/L；引物浓度各为100 nmol/L；模板 DNA为2 µL；1.5 U Taq DNA聚合酶。反应程序为：94 ℃ 3 min ；94 ℃ 30 s ，57 ℃（引物cfl F/R为67 ℃） 30 s，72 ℃ 45 s ，循环35次；最后57 ℃ 5 min 。 4.1.3 电泳分析 扩增产物电泳，EB染色后用凝胶成像系统分析。 取10 μ L扩增产物与3 μ L 6×上样缓冲液混合均匀，在1.5 %琼脂糖凝胶1×TAE缓冲液中(4 V-6 V/cm)电泳30 min，核酸染料染色后凝胶成像系统分析。如果PCR初筛结果2对引物扩增均为阳性，需继 续以下验证。 4.2 分离培养