柱色谱分离快与速柱层析.ppt

柱色谱分离快与速柱层析;色谱分离法分类;色谱流出曲线;从色谱流出曲线中，可得许多重要信息： (1) 根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含 组分的最少个数； (2) 根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析； (3) 根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析； (4) 色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据； (5) 色谱峰两峰间的距离，是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。;色谱分离中的重要参数;色谱分离的热力学性质;塔板理论;理论塔板高度越低，在单位长度色谱柱中就有越高的塔板数，则分离效果就越好。 决定理论塔板高度的因素有：固定相的材质、色谱柱的均匀程度、流动相的理化性质以及流动相的流速等。 塔板理论是基于热力学近似的理论，在真实的色谱柱中并不存在一片片相互隔离的塔板，也不能完全满足塔板理论的前提假设。 塔板理论虽然能很好地解释色谱峰的峰型、峰高，客观地评价色谱柱地柱效，却不能很好地解释与动力学过程相关的一些现象，如色谱峰峰型的变形、理论塔板数与流动相流速的关系等。 ;速率理论;速率理论;分子扩散项 B / u （纵向扩散项） 纵向分子扩散是由浓度梯度造成的。组分从柱入口加入，其浓度分布的构型呈“塞子”状。它随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，“塞子”必然自发的向前和向后扩散，造成谱带展宽。分子扩散项系数为 B = 2γ Dg γ-弯曲因子，填充柱γ 1 空心柱γ = 1 Dg-组分在流动相中的扩散系数 ;速率理论;快速柱层析色谱-Flash high-performance flash chromatography system;;Flash柱的选择及上样方式;Flash正相色谱Rf值与柱体积关系;Flash反相柱; 以Biotage LS为例，最大压力可达15bar，配备750g和1500g硅胶量的SNAP专用分离柱，最多一次可分离超过150g样品；流速最高达到500mL/min，只需30分钟就可以分离多达几十克样品。;Flash柱分离应用实例-1;前言 微囊藻素是由水华藻在淡水以及海洋环境中产生的一类肝毒素类环多肽结构。其通过抑制真核细胞的蛋白磷酸酶在细胞生长、蛋白合成、糖原??谢以及肌肉收缩等方面扮演重要角色。 高效薄层色谱与高电压纸电泳仅能实现微囊藻素微克级别的提纯。其难度在于微囊藻素仅占海藻细胞干重的0.7%，且其极性范围较大。 该工作使用反相flash柱从水华藻细胞中提纯克级的微囊藻素。;实验部分 （1）微囊藻素的萃取 浓缩的细胞浮渣物经过甲醇萃取、离心、萃取、旋干除溶剂得提取物。 提取物通过flash柱以提取物:甲醇:水（1:1:1.8）洗脱剂进行分离。 （2）浓缩、纯化微囊藻素 使用Biotage Flash 75 S system，压力为137.8×107 Pa，9×7.5 cm 色谱柱内装载两种固定相：球形Hyperprep C18或不规则Bondapak C18填料。 流速：100 ml/min。 甲醇浓度0 - 100% 梯度洗脱。 238 nm分光光度计检测。 HPLC进行纯度分析。 （ 3）去盐和浓缩 ;Flash柱分离应用实例-1;Flash柱分离应用实例-1;Flash柱分离应用实例-1;Flash柱分离应用实例-1;Flash fractions were pooled to give three main fractions which were analysed by reversed-phase HPLC with diode-array detection: (a) fraction 1 containing predominantly an uncharacterised microcystin (2); (b) fraction 2 contained predominantly MC-LR (5) and MC-LY (8); (c) fraction 3 contained hydrophobic microcystins 12, 13, 14 and 15 and an uncharacterised microcystin (1).;Analysis of purified MC-LR (5) by reversed-phase HPLC with dio