大肠杆菌培养基配制及培养方法.pdf

大肠杆菌培养基配制及培养方法--第1页 大肠杆菌培养基配制及培养方法 大肠杆菌培养 一、菌种冻存液的制备 所含足量细菌的液体培养基 Vergt 后在结晶中重新加入等量 40%甘油，-80oc 冻存。 二、培养基制取 lb 培养基配方（胰化蛋白胨（trypton）：10g/l；酵母提取物（yeastextract）： 5g/l；nacl：10g/l；ph7.4） 液体培养基 胰化蛋白胨 10.0g 酵母粉 5.0g 氯化钠 10.0g 水 1000mlph7.4 液态培养基在液体培养基的基础上再重新加入 1.5％－2.0％的琼脂三、平板的制取 1）称取胰化蛋白胨 10.0g，酵母粉 5.0g，nacl10.0g，加入 800ml 二次水溶解，并用 玻璃棒搅拌均匀，用 1mol/l 的naoh 调 ph 至 7.4 左右，定容至 1l，调 ph7.4 （若溶液ph 大于 7.4，用 1mol/lhcl 回调）。 2）灌装在锥形瓶中，每瓶量不必太多，没有过瓶底一指左右。例如须要液态培养基 在灌装后的液体培养基内重新加入约 2%的琼脂（150ml 液体培养基重新加入 2.5g 琼脂）。 3）在锥形瓶口依次全面覆盖拎滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋放进去。所有锥 形瓶例如上述操作方式。用记号笔标明培养基名称、酿制日期。4）高压蒸汽杀菌锅 121oc 杀菌 15min。 5）灭菌后的培养基取出置电热鼓风干燥器内60oc 烘干，待锥形瓶的封口纸干燥后取 出。液体培养基可直接保存或使用，此时加有琼脂的培养基不会凝固，可在预先紫外杀菌 30min 以上的无菌操作台上，将培养基倒入培养皿内，每个培养皿培养基约10-15ml （直 径 90mm），在培养皿中厚度大约4mm 左右。将平皿叠放在无菌操作台上，放置 10min 左右， 待琼脂基本凝固可涂平板。6）若平板不直接使用，灭菌后将培养基在锥形瓶中保存，待 需制备平板时，微波炉中火加热约 3min，使琼脂熔化，室温冷却20min 至不烫手可制备平 板。四、接种大肠杆菌 1）挑实验室储备的大肠杆菌bl21 冻存液，管口用酒精灯灼热，关上离心管。2）注 射方法一：用杀菌枪头煮取冻存液在平板边缘上划出横条，每三道为一组，转动平皿一圈， 最后中间划出之字；注射方法二：用移液枪汲取 100ul 溶液于平板上，用酒精灯杀菌薄的 涂抹棒划十字，涂敷平板。 3）因实验一般都要求挑取单菌落，故涂平板适应考虑冻存液内细菌数量，若菌量过 大应适当稀释。一般方法一获得单菌落的可能性比较大。涂平板应在酒 大肠杆菌培养基配制及培养方法--第1页 大肠杆菌培养基配制及培养方法--第2页 精灯附近展开，若冻存液涂回去的平板应当倒转，避免平皿砌上产生水蒸气。五、大 肠杆菌的培育 1）将接种好的平皿倒置放入37℃的恒温培养箱中培养，大约十几小时后长出菌落。 2）挑取生长状态不好，特征显著的单个菌落，注射于新鲜杀菌的lb 液体培养基中 37℃，220rpm/min 恒温震荡培育 9-12h。菌落特征：乳白色，圆形，菌落边缘整齐，表面 扁平，表面和背面颜色一致。 大肠杆菌培养基配制及培养方法--第2页