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糖在蛋白质药物冷冻干燥过程中保护作用的分子机制 【关键词】蛋白质 摘要论述了冷冻干燥过程对蛋白质药品的损伤及糖类在此过程中的保护作用机制,并分析了蔗糖、葡萄糖、海藻糖、葡聚糖等几种糖作为保护剂的功能特点。 关键词糖;冷冻干燥;蛋白质;保护剂 1 冷冻干燥的损伤作用 冷冻干燥的实质是物质(水蒸汽)和能量的转换传递〔3〕。生物材料在冻干时,必须经历水变成冰的冻结过程。这是一个物理学的状态变化,同时还伴随着化学变化。这些变化,将使受冻结的生物材料受到影响〔4〕。 蛋白质冷冻干燥全过程分为预冻、第一阶段升华干燥和第二阶段再干燥。预冻过程中水结冰时体积增大,致使活性物质活性部位中一些由弱分子力键连接的键遭到破坏,从而使活性损失;另外,水结冰后引起溶质浓度上升以及由于各种溶质在不同温度条件下溶解度变化不一致而引起pH值的变化,导致活性物质所处的环境发生变化而造成失活或变性。 在第一阶段升华干燥时90 %以上的水分被升华除去。第二阶段再干燥主要是除去药品中的残留水分。残留水分过多,生化活性物质容易失活,大大降低了稳定性。Thomas〔5〕报道,残留水分的水平对冻干物质的是否产生非定形的结晶相当重要。控制冻干药品中的残留水分,关键在于第二阶段再干燥的控制。因此在实际操作中,应该在保证药品活性的条件下,选择能允许的最高温度进行第二阶段再干燥,真空度的控制尽可能提高,有利于残留水分的逸出。但冻干品的水分并不是越低越好〔6〕。因为每种蛋白质药品都含有合适的剩余水分来保持在储存过程中性质的稳定,过度的干燥将使蛋白质分子表面的氢键和极性基团暴露而变性。另外,Shan〔7〕的研究表明残留水分对蛋白质活力的回复影响最大。 0. . 除此之外,在冷冻贮藏中,由于冰晶与蛋白质的水合水的相互作用,使冰晶接近蛋白质的水合层,形成格子构造,水合层的水分子向冰晶的方向移动,产生脱水合现象,使蛋白质的水合构造遭到破坏〔8~10〕。因而使蛋白质的高级结构发生改变,蛋白质的生理功能受到影响。 关于冷冻干燥对蛋白质的变性机理目前普遍认为在冷冻干燥过程中冷冻和干燥都会引起蛋白质变性。Dean〔11〕认为在冷冻过程中缺少保护剂的情况下,蛋白质将失去活性;而脱水过程本身能使蛋白质损伤,从而使复水后的蛋白质失去活性。许多学者认为蛋白质分子周围分布着多层水分子,在降温过程中,蛋白质分子周围的水分子不断冻结,但只要蛋白质分子表面的单层水分子没有冻结,则蛋白质就不会变性;反之,蛋白质就会变性。Hanafusa 〔12〕利用在冷冻干燥过程中把卵清蛋白(ovalbumin)和肌球蛋白(myosin)进行了冷冻干燥对比实验,表明正是由于蛋白质表面覆盖着没有冻结的单层水分子,才使蛋白质在冷冻过程中不发生变性作用。当蛋白质表面的单层水分子开始冻结时,蛋白质分子表面的氢键以及极性基团就会暴露在周围环境中而变性。同样,在干燥过程中也应保证蛋白质分子表面的单层水分子不受到破坏。因此,在冷冻干燥蛋白质药物的过程中,一般要加入保护剂,防止由于 蛋白质表面的单层水分子破坏而引起蛋白质的变性。 2 糖的保护作用机理 关于糖生物保护作用的机理,仍在研究和探讨之中。目前主要有两种。第一,认为由于蛋白质分子中存在大量氢键,结合水通过氢键与蛋白质分子联结。当蛋白质在冷冻干燥过程中失去水分后,蛋白的主相变温度会升高。但某些糖的羟基能替代蛋白表面的水的羟基,使得蛋白的主相变温度变化不大,低于操作温度,从而避免了生物活性物质由于发生相变所造成的机械损伤。即在冻干过程中,由于糖类属于亲水性物质,形成氢键能力较强,在氢键形成中即可以作为孤对电子的受体,又可以作为供体,因此,在蛋白质冻干过程中糖的羟基可与蛋白质中的极性基团形成氢键,从而代替蛋白质极性基团周围的水分子,使蛋白质表面形成一层假定的水化膜,这样可保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境中,稳定蛋白质的高级结构,防止蛋白质因冻干而变性,使其即使在低温冷冻和干燥失水的情况下,仍保持蛋白质结构与功能的完整性〔13~14〕。这是“水替代假说”。许多研究者赞成这种观点。首先能够直接测量冻干的蛋白质与保护剂蔗糖间的氢键〔15〕,从而显示出蔗糖对蛋白质的保护作用;其次,Dean〔11〕等在分别研究蔗糖、葡聚糖、蔗糖与葡聚糖的混合物对冷冻干燥过程中蛋白质的保护作用时发现,保护剂是否具有保护作用,关键在于保护剂在蛋白质脱水后能否与氢键结合。一些研究者曾用傅立叶变换红外光谱分析法研究了海藻糖对大肠杆菌DH5α和苏云金杆菌HD-1冻干后蛋白质结构的作用,表明:不加海藻糖时,结构蛋白的酰胺Ⅱ峰从水化细胞的1543 cm-1移至1533 cm-1;添加海藻糖后,结构蛋白的酰胺Ⅱ峰的位置没有改变〔16〕。从而证实,海藻糖作为保护剂在冻干过程中对蛋白质结构具有保护作用,也为“