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分子生物实验技术第1页/共106页 一、DNA提取原理和方法 核酸的理化性质 ：DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。第2页/共106页 DNA提取原理 天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把蛋白除去，再除去细胞中的糖，RNA 及无机离子等，从中分离DNA。第3页/共106页 步骤1、细胞破碎 三种方法 机械方法：超声破碎法、研磨法、匀浆法；?化学试剂法：SDS处理；?酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，使细胞壁破碎。第4页/共106页 DNA提取的几种方法 (1) 浓盐法：A. 利用RNA和DNA在电解液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯化钠溶液抽提,得到的DNP粘液与氯仿：异戊醇（24:1）一起振荡，使乳化，再离心除去蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中，用2倍体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来。B. 用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP，再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白，再按氯仿-异戊醇法除去蛋白。A/B两种方法比较, B法使核酸降解可能少一些。第5页/共106页 C. 以稀盐酸溶液提取DNA时，加入适量去污剂，如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制样品中的DNase对DNA的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂。通常用1.5M NaCl，0.015M柠檬酸钠（并称SSC溶液）提取DNA。 第6页/共106页 （2）阴离子去污剂法????? 用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA，由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合，阴离子去污剂能够破坏这种价键，所以常用阴离子去污剂提取DNA。第7页/共106页 （3）苯酚抽提法? 苯酚作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase的活性。用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA 。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态 。 第8页/共106页 （4）水抽提法? 利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后，用低盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分溶解于水中，离心后收集上清液。在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M。加入2倍体积95%乙醇。立即用搅拌法搅出。然后分别用66%、80%和95%乙醇以洗涤，最后在空气中干燥，即得DNA样品。此法提取的DNA中蛋白质含量较高，故一般不用。为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS。第9页/共106页 环境样品常见的有水样、土壤、生物膜等水样可以先用0.22um的微孔滤膜过滤，然后把微孔滤膜剪碎，用于提取DNA土壤、垃圾、生物膜、活性污泥这些样品因为杂质较多，在提取时要考虑杂质的影响，可先预处理去除一部分干扰物质后再提取具体方法很多：直接提取法、间接提取法第10页/共106页 1、水样DNA提取用0.22um微孔滤膜过滤水样，将滤膜放入离心管，加TE 充分震荡混匀，12000rpm收集菌体，再悬浮于1ml TE，加20ul 20mg/ml 溶菌酶，室温10min；加40ul蛋白酶K，37度1h，加1/3体积5M NaCl，剧烈震荡混匀， 12000rpm 离心5min，上清液用酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）抽提两次，上清液加0.6V异丙醇沉淀离心后70%乙醇洗涤沉淀，再溶于TE中，加1/10V 3M pH5.2 NaAc后，2.5V 无水乙醇沉淀，70%乙醇洗涤后溶于50ul TE中，测定A260/A280， A260/A230 确定DNA的纯度和浓度A260/A280 : 是衡量蛋白质污染程度的指标，通常在1.7-1.8之间较好； A260/A230：衡量腐殖酸污染程度的指标，一般在1.7-2.0 之间较好。第11页/共106页 常用试剂盒品牌MP Bio公司Fast-Prep SPIN Kit（for soil）Mo Bio公司ultra clean soil DNA kit power clean soil DNA kit Qiagen公司：QIAamp DNA Stool Mini KitOmiga