凝胶层析法分离不同分子量物质实验.pdfVIP

凝胶层析法分离不同分子量物质 实验步骤： 1 ，凝胶准备（已准备）：称取交联葡聚糖 G-100 1g，置于锥形瓶中， 加蒸馏水30ml ，于沸水中煮沸1h 取出，待冷却至室温再进行装柱。 2, 装柱 （已准备）：取直径 1cm，长度20cm 层析柱垂直地安装好。 将已经溶胀的凝胶沿着玻璃棒小心的徐徐灌到胶中，尽量一次倒完避 免出现断层，如不能一次倒完，用玻璃棒搅拌上层凝胶，再继续加入 剩下的凝胶。待凝胶沉淀压实后，再在凝胶上面加1-2ml 的水，将胶 面压平。 3 ，样品的制备 （已准备） （1）血红蛋白的制备 称取牛血红蛋白0.2g，充分溶解于10 ml PBS 缓冲液中 （超声促进 溶解），冰箱备用。 （2）核黄素（维生素B ）的制备 2 称取核黄素 0.1g，充分溶解于10 ml 稀NaOH 溶液中，冰箱备用。 （3）蓝色葡聚糖2000 的制备 称取蓝色葡聚糖2000 0.1 g，充分溶解于蒸馏水中，冰箱备用。 （4）层析混合样品制备 取血红蛋白溶液 0.3 ml，核黄素溶液 0.1 ml，蓝色葡聚糖2000 0.1 ml，充分混匀作为样品。 4 ，加样 加样时先将柱子接上蠕动泵（另一端不接洗脱液），使柱床表面的 蒸馏水流出，直至床面正好露出，关闭蠕动泵 （或用胶头滴管将柱床 面多余水吸出，注意滴管不要碰到柱床面）。用移液器将上述样品（约 0.5 ml）缓缓沿层析柱内壁小心加于床表面，注意尽量不要使床面搅 动。待样品进入床内，直到床面积重新露出，再在柱上面加 1-2ml 的蒸馏水 （用胶头滴管沿柱子内壁旋转加入），蠕动泵的另一端接上 洗脱液，用水进行洗脱。 5 ，洗脱 将蠕动泵一端接洗脱液一端接柱子，控制流速为1ml/min （蠕动泵 数值200 左右），进行洗脱，柱子上端接蠕动泵，下端接部分自动收 样器，进行收集，1 分钟收集1 管，每管大约1ml。 6, 观察 观察样品在层析柱中色带位置及洗脱顺序，计算样品的洗脱体积。 实验结果分析： 洗脱顺序：蓝色葡聚糖2000 血红蛋白 核黄素 红色血红蛋白 洗脱体积：计算从加样到样品洗脱下来流出的总体积。 存在问题：红色血红蛋白颜色特别浅。