备课素材：PCR技术及应用 高二下学期生物人教版选择性必修3.docxVIP

PCR技术及应用 一．PCR技术的原理和特点 1. PCR原理 ①在80－100°C的温度范围内， DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性； ②当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链； ③ PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。 2. PCR技术的特点 PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出 3.PCR反应的体系 总体积为20 uL 、30 uL 或100 uL等 二、PCR的实验操作 （一）设备及用具 1、PCR仪 实质上是能够自动调控温度的仪器 2、微量离心管 一种薄壁塑料管，总容积为0.5mL 3、微量移液器 用于定量转移PCR配方中的液体 不同规格的移液器配套使用不同大小的枪头。 每吸取一种试剂后，移液器上的一次性枪头都必须更换。 (二）PCR的反应过程 PCR扩增图解 （三）PCR引物设计原则 PCR的首要任务就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物。 PCR引物是人工合成的两段寡核苷酸。一个与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补， 另—个与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。引物是PCR特异性反应的关键。 设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和高效性。 ①退火温度要适宜 一般引物的长度为15-23bp，常用的长度为 18-21bp。过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq 酶进行反应。过短特异性差。 ②引物自身及引物之间不应存在互补序列 引物3端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高， 而其它三种碱基的错误引发效率相对小一些。 3端防止连续三个C或G?引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。? 碱基要随机分布，且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。否则引物自身会折叠成发夹结构或二聚体，从而影响引物与模板的复性结合。 ? 1、发夹结构（Hairpin） 自身互补 2、二聚体（Dimer） 两个引物间互补 ③引物5端可以修饰，3端不可修饰 引物的5端可以修饰，而3端不可修饰，引物的5 端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰包括：加酶切位点，加标记荧光，引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。引物的延伸是从3端开始的，不能进行任何修饰。在引物的5`端连接一对限制酶的识别序列，这样便于目的基因连接到载体上。 ④引物长度要适宜 ⑤引物GC含量要适宜 退火温度高，扩增特异性强；退火温度低，扩增效率高。 如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，使DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4℃～6℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的。 双酶切优点： 使DNA片段能定向插入表达载体，防止自连 三．PCR应用 1、反向PCR测定未知DNA区域 当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理是：用限制性内切核酸酶消化该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。 2、PCR定点突变技术—重叠延伸PCR 该技术要使用四条引物。其中引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点，而这两条引物有部分碱基（包括突变位点）是可以互补的。因此，分别利用引物1和2，引物3和4进行PCR后，得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起，再在DNA聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的DNA片段。最后，用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。 3、PCR定点突变技术—大引物PCR 大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。该技术的流程如图所示。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。 传统PCR结果分析 对扩增后的DNA染色处理后凝胶电泳分离。DNA电泳是根据DNA分子大小