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第1页/共33页基因工程极其应用第2页/共33页培育转基因大肠杆菌的简要过程普通大肠杆菌(不能分泌胰岛素)人体组织细胞提取与运载体DNA拼接导入大肠杆菌(含胰岛素基因)胰岛素基因转基因大肠杆菌(能分泌胰岛素)你认为上述培育转基因大肠杆菌的关键步骤有哪些？第3页/共33页1.ONE2.TWO3.THREE胰岛素基因从人体细胞内提取出来胰岛素基因与运载体DNA连接胰岛素基因导入受体(大肠杆菌)细胞基因的“剪刀”基因的“针线”基因的运载体培育转基因大肠杆菌的关键步骤第4页/共33页 （一）基因操作的工具基因的剪刀—限制性内切酶（简称限制酶） 限制酶是在生物体(主要是微生物)内的一种酶，能将外来的DNA切断，由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。 特点：专一性。 即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。第5页/共33页 大肠杆菌(EcoRI)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。限制酶第6页/共33页AATTCCGTAG GGCATCTTAACTTCATG AATTCCCTAA CTTCATG AATTCCCTAA AATTCCGTAG 目的基因 GAAGTACTTAA GGGATT GAAGTACTTAA GGGATT GGCATCTTAA练习使用EcoRI 剪切目的基因黏性末端第7页/共33页什么叫黏性末端？ 被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。第8页/共33页（二）基因操作的工具基因的针线——DNA连接酶磷酸二酯键 DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。第9页/共33页AATTCCGTAG AATTCCGTAG 乙片段GGCATCTTAAGGCATCTTAACTTCATG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGGATT 使用DNA连接酶制作重组DNA分子甲片段重组DNA分子第10页/共33页（二）基因操作的工具 外源基因(如抗虫基因)怎样才能导入受体细胞(如棉花细胞)？导入过程需要运输工具——运载体。运载体的作用有哪些？作用一：作为运载工具，将外源基因(抗虫基因)转移到受体细胞(棉花细胞)中去。作用二：利用运载体在受体细胞(棉花细胞)内，对外源基因(抗虫基因)进行大量复制。第11页/共33页基因的运载工具——运载体：常用的运载体主要有两类： 1）细菌细胞质的质粒 2）噬菌体或某些动植物病毒第12页/共33页restriction endonucleaseDNA linking-enzymeDNA linking-enzyme运载体1.能够在宿主细胞内复制并稳定保存；2.具有多个限制酶切点以便与外源基因相连；3.具有标记基因，便于进行筛选．胰岛素基因第13页/共33页四个基本步骤：1）提取目的基因2）目的基因与运载体结合3）将目的基因导入受体细胞4）目的基因的检测和表达（三）基因操作的基本步骤第14页/共33页（三）基因操作的基本步骤目的基因 目的基因是人们所需要转移或改造的基因。 如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。直接分离基因人工合成基因目的基因的提取方法第15页/共33页（三）基因操作的基本步骤目的基因与运载体重组 1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。 2）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。 3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重组DNA分子（重组质粒） 目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。第16页/共33页（三）基因操作的基本步骤目的基因导入受体细胞常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。第17页/共33页（三）基因操作的基本步骤氨苄青霉素抗性基因四环素抗性基因目的基因的检测和表达第18页/共33页（三）基因操作的基本步骤 受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？ 不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。第19页/共33页乳汁中含有人生长激