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实验五聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白
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2
实验五 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白(Polyacrylamide Gel Electrophoresis,PAGE)
动物医学院动物生化教研室
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3
掌握聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的原理;
学习聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的操作技术;
了解血清蛋白的主要成份。
一、实验目的
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4
二、实验原理
不连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳中,蛋白样品通过浓缩胶的浓缩按分子大小排列成层,然后进入分离胶,随着电泳的不断进行,不同大小、电荷的蛋白质分子逐渐被分开。
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5
Bis将单体长链连成网状结构
TEMED催化AP生成硫酸自由基
1、聚丙烯酰胺凝胶生成
催化Acr聚合成长链
Acr:丙烯酰胺
Bis:甲叉双丙烯酰胺
AP:过硫酸胺(催化剂)
TEMED: N, N, N′,N′-四甲基乙二胺(加速剂)
Acr、Bis决定孔径大小
AP、TEMED决定聚合速度
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6
连续胶电泳
采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统(样品缓冲液、凝胶缓冲液
和电极缓冲液),在pH恒定、离子强度相同的条件下进行。
优点:
制胶简单、快捷
缓冲液pH值恒定,可以防止样品进胶后因pH值改变发生的凝聚和沉淀
缓冲系统组成简单,来源广泛
缺点:
分辨率不高
2、连续胶和不连续胶电泳
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7
不连续胶电泳
采用不相同孔径的凝胶和不同缓冲系统的电泳方式,在电泳分离过程中,由
于浓缩胶的堆积作用,可使样品在浓缩胶和分离胶界面上先浓缩成一窄带,然后
在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离。
优点:
分辨率高
用于复杂和特殊样品的分离
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8
不连续电泳的三种物理效应
样品的浓缩效应
凝胶的分子筛效应
电荷效应
电泳的过程三种效应同时存在,对蛋白样品起协同作用,使样品各组分按照带电量、分子质量及形状按一定的顺序分离。
不连续电泳的四种不连续体系
凝胶的不连续
缓冲液成份的不连续
缓冲液pH值的不连续
电压梯度的不连续
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9
三、实验步骤
封槽
清洁、干燥的小玻管一端,用Parafilm贴封后垂直放在管架上
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10
分离胶:A:C:D:E=1:2:3:2(V/V)
浓缩胶:B:C:D:E=2:1:5:2(V/V)
A: pH8.9 Tris/Hcl缓冲液
B: pH6.7 Tris/Hcl缓冲液
C: 30% Acr-Bis贮存液
D: 水
E: 过硫酸铵 灌装前加入TEMED,混匀
取干净玻璃管,下端封口膜封好(重要);用注射器加分离胶至管口1-2cm处,封水(沿管壁,动作要慢);凝固后弃水、吸干;加浓缩胶距管口2-3mm处、封水;凝固后备用。
制胶和灌胶
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11
加样
用微量注射器取样品液15μl,针头伸入玻璃管上口,沿壁加在浓缩胶面上,缓慢注入。
电泳
连接电极,上负下正;
浓缩胶:3mA/管,分离胶:4mA/管;
待示踪染料接近凝胶管底部约0.5cm处,切断电源。
剥胶
取下凝胶管,用注射器吸取一定量的蒸馏水,将针头插入胶柱-与管内壁之间,边注水边旋转玻管,直至胶柱与管壁分离,然后用洗耳球轻轻在玻管的一端加压,使凝胶柱从玻管缓慢滑出,将凝胶柱置于干净的试管内,用蒸馏水冲洗几次。
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12
染色
将凝胶柱置于0.05%氨基黑10B溶液中浸染20min,然后再浸入7%醋酸溶液中 脱色。
血清蛋白在凝胶柱上可分出十多条色带。
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