江南大学抗生素发酵的代谢与控制.ppt

* ③正亮氨酸和Met的作用机制相同，它们作为一种调节物对头孢霉素C的合成起促进作用 头孢霉素C 相对产量 培养基中Met含量 正亮氨酸 正亮氨酸也能诱导菌丝体分节为节孢子 * 8.1.8 选育青霉素生产菌的方法 1、出发菌株的选择 主要是产黄青霉（P.Chrysogenum ）51-20和点青霉 （P. notatum） 发酵单位：几十个单位 发酵单位：原种发酵单位：原种→100U/mL；诱变诱变→30000U/mL * 2、切断代谢之路 （1）菌株的初级代谢和次级代谢处于分支代谢途径时， 初级代谢产物的营养缺陷型突变株可使相应的次级代谢产物 增加产量。 Leu-突变株，青霉素产量提高四倍 （2）青霉素的合成收到Lys的反馈抑制（抑制高柠 檬酸合成酶），选育Lys -突变菌株，并在培养基中限量添加Lys * * * 3、切断菌体自身的反馈调节 （1）选育结构类似物抗性突变株 Leu结构类似物 三氟亮氨酸 * （2）筛选自身耐受性突变株 不同菌株自身对产物耐受性不同，耐受性突变株可能是由于产物对合成途径中某一酶的反馈抑制被解除。 青霉素V 实例： 筛选抗青霉素V的菌株 产量提高到40000 U/mL * (3)筛选前体或前体结构类似物抗性突变株 选育毒性前体（或其结构类似物）抗性突变株，可以消除 它们对生物生长与产物合成的抑制作用，提高产物合成。 苯乙酸或苯乙酰胺 青霉素V ：选育耐13 g/L的苯氧乙酸突变株，产量可达到50000U /mL 同理，可以选育苯乙酸或苯乙酰胺抗性突变株来提高维生素G的产量 * （4）选育营养缺陷型回复突变株 当一种初级代谢产物是次级代谢产物的前体时，这种初级 代谢的营养缺陷型回复突变株就有可能是次级产物高产菌株。 α-氨基己二酸缺陷回复突变株 半胱氨酸营养缺陷回复突变株 * * 4、增加前体物质的合成 ①增加Val：选育对乙酰羟酸合成酶反馈抑制较小的突变株 丙酮酸 乙酰乳酸 Val ②增加α-氨基己二酸：基因工程技术克隆同型柠檬酸合成酶 基因，使其在细胞内扩增；进一步体外诱变，使同型柠檬酸 合成酶不受Lys的反馈抑制，增加增加α-氨基己二酸的合成量。 乙酰羟酸合成酶 * 5、选育形态突变株 长期选育过程发现：青霉素产量逐步提高的过程中，菌落直径逐渐变小，菌落表面由平坦变为褶皱，孢子也减少。 可以依据此变化，寻找高产菌株。 深层培养时，菌丝形态的突变有利于溶氧时，也会有利于提高产量。 * 6、其他标记 （1）筛选抗生长抑制剂突变株 筛选抗重金属离子突变株（Cu2+,Hg2+,Co2+） 原因：重金属离子本身对细胞有毒性，与青霉素结合能消除 毒性，产生抗性菌株 （2）筛选耐消泡剂的突变株：减少消泡剂的用量，提高溶氧 方法：培养基中加入消泡剂进行筛选 （3）选育细胞膜渗透性好的突变株 实例：产黄青霉细胞膜渗透性发生突变，摄取无机硫酸盐能力增强，由于S元素参与半胱氨酸合成，这样青霉素的产量也得以提高。 * （4）构建基因工程菌株 青霉素G酰化酶（pac） E.coli D816 最适温度和通风条件， 产量3000 U/L * 8.1.9 青霉素发酵控制 1、碳源 ◎青霉菌能利用多种碳源，如乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、天然油脂等。 乳糖是最好的碳源，葡萄糖在使用时，需要控制加入的浓度，常采用流加葡萄糖的方法来替代乳糖。 * ◎苯乙酸或苯乙酰胺、苯乙酰甘氨酸均可作为青霉素G的侧链前体。 菌体对前体的利用有两个途径：直接结合到分子中或作为养分，氧化为CO2和H2O。两个途径的比例主要取决于培养条件和所用菌株的特性。 为避免浓度过大造成菌体伤害，除基础料中加入0.7 g/L前体外。其余按需要与氮源一同补入。前体的供应速率略大于生物合成的需要。 * 2、pH pH 过高 添加糖、硫酸盐或无机氮源(避免超过7.0) pH 过低 添加CaCO3、NaOH、氨水、尿素或提高通风量 自动流加酸碱，控制发酵液pH维持在6.8-7.2 两种补糖策略 恒速补糖，酸或碱控制pH 根据pH来补糖（ pH 变化上升大，就多补） * 3、温度 青霉菌的最适生长温度为30 oC,产物青霉素合成的最适温度为20 oC。 变温控制：不同阶段不同温度 生长阶段：较高温度，缩短生长时间；生产阶段适当降低温度，有利于青霉素的合成