浅谈乙肝病毒检测.pptxVIP

浅谈乙肝病毒检测;病毒鉴定方法;乙肝病毒检测; HBV抗原抗体系统检测临床意义;第5页/共26页;第6页/共26页;二、乙肝病毒核酸定量检测;PCR分四个阶段;如何定量？;定量原理;荧光化学;TaqMan;SYBR Green I 工作原理;2.所用试剂;3、实验步骤;4.PCR扩增 对各标本进行标记 反应条件： 93℃ 2分钟 93℃ 45秒→55℃ 60秒→10个循环 93℃ 30秒→45℃ 60秒→30个循环 FAM通道检测HBV核酸，VIC通道检测内标 ;4.结果判定 1 如果在FAM检测通道检测扩增曲线无明显对数期或Ct值等于30，VIC检测通道扩增曲线有明显对数期，则为阴性或小于检测灵敏度 2 FAM检测通道扩增曲线有明显对数期且Ct值小于30 按以下方法判断： C100,HBV DNA浓度100 IU/ml 100≤C ≤ 5.0E+008 ,HBV DNA浓度=C IU/ml C5.0E+008 ,HBV DNA浓度5.0X108 IU/ml 如需精确定量结果，可将样品用阴性质控品稀释到线性范围后再检测，则样品HBV DNA浓度=（CX稀释倍数） IU/ml ;5.注意事项 1 每次实验需检测阴性质控品、HBV强阳性质控品、 HBV临界质控品，满足要求方可进行判定（阳性质控品Ct30，阴性质控品无明显对数期或Ct值等于30 VIC检测通道扩增曲线有明显对数期） 2 本试剂盒的最低检出浓度为30IU/ml，最低定量浓度为100IU/ml 3 所有样品包括质控品均按传染性标本对待严格遵循无菌操作（带口罩手套），所有操作在生物安全柜内操作，物品不能随意带出生物安全柜，用完的物品集中放置高压灭菌后方可处置。 ;一、乙肝病毒e抗原检测;第20页/共26页;2.所用试剂;3、实验步骤;5.加酶 每空加酶标抗体50 μL，混匀（空白对照不加） 6.温浴 37℃温浴25分钟，室温平衡5分钟（封口膜覆盖孔口，避免其他因素影响） 7.洗涤 洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间） 8.显色 每孔加入A、B底物50 μL，混匀，37℃暗置15分钟 9.终止 每孔加50 μL终止液50 μL，混匀 10.测定 酶标仪单波长450nm或双波长450/630nm测定各空OD值，记录结果,30分钟内测定完成） ;4.结果判定 1. 临界值(C.O)计算 临界值=阴性对照孔OD值均值N X 2.1 注意：阴性对照孔均值N大于0.1应重新实验，小于0.05按0.05计算 2. 结果判定 样品OD值/ C.O ≥1为HbeAg阳性 样品OD值/ C.O 1为HbeAg阳性 3.阴性对照孔均值N大于0.1或阳性对照均值≤0.4实验无效，应重新实验;5.注意事项 1. 洗涤时各孔均加满，防止孔内有游离酶未洗净影响结果 2. 所有样品包括质控品均按传染性标本对待严格遵循无菌操作（带口罩手套），所有操作在生物安全柜内操作，物品不能随意带出生物安全柜，用完的物品集中放置高压灭菌后方可处置。 3.微孔板拆封后，取出当天用的微孔条后，其余用封口膜封存避免受潮 ;感谢观看！