肿瘤分子检测与质量控制.pptxVIP

第1页/共35页肿瘤分子检测与质量控制第2页/共35页医学发展历程的启示经验医学循证医学精准医学诊断靠治疗后期经验积累。诊断治疗以人群、科学研究证据指导临床实践。诊断治疗以个体为基础，更加提前、具体与精确。分子时代第3页/共35页第4页/共35页0.7%腺癌鳞癌肺腺癌：EGFR\KRAS\BRAF\ALK-ROS1\RET等检测已是共识；肺鳞癌发生模式不同，检测靶标以扩增为主，同时EGFR、ALK\ROS1某些病例也有必要检测。0.7%0.8%2.2%0.1%2.6%3.3%7.8%36%21%25%第5页/共35页我们可以用的分子生物学手段：实时荧光PCR方法（扩增阻碍突变系统法（Amplification Refractory Mutation System，ARMS）、PCR-高分辨溶点曲线分析（HRM）、数字PCR等）PCR-杂交法（膜上、芯片[基因芯片] 、乳胶颗粒[Luminex]）PCR-Sanger测序PCR-焦磷酸测序新一代高通量测序PCR-SSCP、RFLP、dHPLC等荧光原位杂交（FISH）直接杂交免疫组化基因表达(mRNA/RNA expression）蛋白(质)表达(Protein expression)第6页/共35页基因突变(SNPs)DNA sequencing， ARMS…反转录+荧光定量PCR（RT-qPCR)…免疫组织化学（IHC）…拷贝数改变(Copy Number Variation, CNV)基因重排（Gene rearrangement)FISH…分子病理检测的主要方法检测水平检测对象检测技术检测基因EGFR，KRAS，BRAF，BRCA, BCR-ABL，JAK2…EML4-ALK，ROS1，HER2，RET…BRCA1，TOP2A，TYMS…EGFR，EML4-ALK，HER2…第7页/共35页IPASS大型临床研究所采用INFORM是RT-PCR平台上的特异扩增技术（易开展）共发表300多篇文献著名的大型临床研究 - 如IPASS、INFORM等ARMS技术——被临床证明的肿瘤基因突变检测技术国际肺癌协会专家共识中国基因突变检测专家共识日本临床专家共识第8页/共35页融合mRNA或5’/3’ mRNA差异表达嵌合蛋白表达DNA 基因重排RT-PCR 5’/3’比较qRT-PCRRACE-PCR…IHCFISH/CISH NGS肺癌中ALK基因变异的表达调控第9页/共35页荧光原位杂交技术（FISH）1. FISH技术是美国药物临床试验中所采用的检测方法。2. 采用“分离”分析，基因倒位和ALK重排后，红色和绿色探针分开3. ≥ 15%的样本细胞中呈现分开的红色和绿色信号表示阳性结果1横向纵向2个信号分离直径的要求，使实际应用中结果难以判断有5-11%出现假阳性信号分离1，2，3工作强度大，费时主观性强，受人为因素影响大第10页/共35页PCFusionSample实时逆转录法（Real Time-PCR）NTC操作简单，时间短结果客观，易于判读，减少人为因素的影响除FFPE样本外，还适用其他类型样本组织1与EGFR、RET、ROS1等其他检测不冲突，共用相同组织切片和PCR扩增程序，节约有限资源和时间中国荧光PCR仪器普及率更高，更加适合国情第11页/共35页CFDA批准的基因检测产品项目　EGFRALKROS1ALK/ROS1IHC　　√　　FISH　√　　Real Time-PCR　√　　√　　√　√基于Real Time-PCR方法检测驱动基因的分子诊断产品获得CFDA批准最多第12页/共35页2-3 片FFPE样品同时将DNA和RNA分离出来同时获得EGFR、ALK和ROS1检测结果吉非替尼厄洛替尼埃克替尼阿法替尼DNA/RNA共分离剂盒EGFR突变型EGFR/ALK+ROS1克唑替尼色瑞替尼ALK阳性或ROS1阳性DNA/RNA2.5小时PCR4.5小时FFPE切片1-3片或活检小标本EGFR野生型ALK阴性ROS1阴性其他治疗方式节约样本、节约时间、节约成本第13页/共35页2015 NSCLC NCCN指南对于NSCLC患者建议检测EGFR和ALK基因状态；对于ROS1/MET/RET/BRAF/ HER2等崭露头角的靶基因也给予关注第14页/共35页分子病理实验室的质量控制1.室内质量控制2.室间质量评价第15页/共35页1.建立标准化的实验室2.具备资质且相对固定的人员3.性能稳定的试剂4.持续不断的学习和开展质控第16页/共35页《医疗机构临床基因扩增检验室管理办法》（卫办医政发[2010]194号）《医疗机构临床基因扩展检验实验室工作导则》（卫办医政发[2010]194号）第17页/共35页试剂准备区空气流向标本制备区空气流向扩增区空气流向产物