血液分子生物学基因治疗.pptxVIP

血液分子生物学基因治疗;本章内容提示;基因治疗（Gene therapy?）;一、基因治疗策略 策略：直接基因治疗和间接基因治疗 1、直接基因治疗：纠正突变基因 在原位修复缺陷的基因，以达到治疗目的。为较理想的基因治疗策略，由于存在某些问题，目前正在努力之中。（未实现） ;2、间接疗法： 以正常的基因替代致病基因。 导入外源正常基因，代替有缺陷的基因,使细胞恢复正常功能而达到治疗疾病（尤其是遗传病）的目的。 而对靶细胞而言，没有去除或修复有缺陷的基因。 ;途 径; 1、生殖细胞基因治疗;但还存在某些问题：;2．体细胞基因治疗somatic cell gene therapy; 措 施：;存在的问题;二 、基因治疗的方法;基因治疗首先获得目的基因，通常从基因组中分离 基因克隆 ↓ 定 位 ↓ 表 达 ↓ 评价表达情况;（二）外源基因的转移;（1）物理方法;2）显微注射法（microinjection ）;常用的细胞 （1）受精卵：受精卵→基因操作→注射假孕动物子宫→胚胎→个体。 （2） 胚胎干细胞：从着床前的动物胚胎中分离多功能胚胎干细胞 →基因操作→注射入动物囊胚→形成嵌合体胚胎→嵌合个体。 ; 用显微注射仪将外源基因直接注射入实验动物受精卵中，利用外源基因整合到DNA中，从而得到转基因动物。 特点：导入速度快，操作步骤不复杂，对DNA大小无限制，不需要载体，整合效率较高，它可以直接获得纯系。 缺点：需要贵重精密仪器，技术操作较难，并且外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致死。 ;例：转基因动物的制备;第20页/共62页;; 转基因动物研究大事记 ◇1974年，美国学者Jaenisch应用显微镜注射法把基因导 入真核细胞。 ◇ 1981年，美国科学家将外源基因导入动物胚胎，创立了转基因动物技术。 ◇ 1982年获得转基因小鼠。 ◇ 1987年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英国著名的罗斯林研究所诞生。这只转基因母羊的乳汁中???以分泌α—抗胰蛋白酶。 　　;3）微粒子轰击法;（2）化学法;磷酸钙+DNA → 混合微细颗粒 ↓ 沉淀反应20~30min ↓ 细胞在沉淀物中暴露 5~24h 方法简单，但转化效率低。;（3）脂质体法（liposome）;（4）同源重组法;通过同源重组定点插入珠蛋白基因;（5）病毒介导基因内转移（Viral mediated transfer）;病毒载体; 病毒的分类（1995年） * DNA病毒 * RNA病毒 * 逆转录病毒 病毒的增殖（复制） * 吸附与穿入：细胞膜表面的特异性受体。 * 脱壳：溶菌酶作用下，病毒体释放出基因组核酸。 * 生物合成：病毒核酸的复制及蛋白质的合成。 * 转配与释放：复制出子代病毒的核酸与蛋白质， 在细 胞内装配为成熟的病毒体；并从宿主细胞释放。 ; 逆转录病毒(RNA) 常用的病毒载体 DNA病毒 1) 逆转录病毒（retrovirus） 目前应用最多、最成功. 病毒感染细胞后，其基因组RNA 经逆转录产生双链DNA拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（provirus），前病毒转录产生的正链既是病毒RNA，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。 ;例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因组结构：;◇逆转录病毒载体构建的技术路线 * gag, pol, env 序列去除，保留LTR 和Ψ， 使 逆转录病毒成为无复制能力的缺陷病毒。 * 在gag,pol,env 序列去除的区域，插入目的基因 序列和