FISH技术在血液疾病诊断中的应用.pptxVIP

FISH技术在血液疾病诊断中的应用第1页/共46页 1950197019701990显带时期非显带时期1888提出 染色 体1914染色体 畸变导 致肿瘤1956确定 染色 体46 条1958应用 于血 液学1960发现Ph 染色体 CML显带技 术高速 发展 G/R多种血 液病相 关异常 核型被 发现FISH中期/间期多色 FISH微阵列技术 aCGH、aSNPCGH技术分子遗传细胞遗传学发展简史第2页/共46页 FISH技术的发展1990年 FISH1992年 CGH1996年 24色FISH（SKY、M-FISH、RX-FISH）2001年 array CGH第3页/共46页 技术原理AGGCTATTCCGATACOVALENT BONDFFSpecimen DNAFISH Probe DNA第4页/共46页 操作步骤FISH样本的制备（染色体制备、细胞滴片制备）探针制备（体系：杂交缓冲液、蒸馏水、探针）探针标记杂交（76℃变性10min、37℃杂交10h）洗脱DAPIⅡ复染荧光显微镜检测结果分析第5页/共46页 FISH技术的特点? 操作简便，稳定，人员培训较快? 方法敏感，特异性好，检测效率高，能迅速得到 结果，24小时就可以完成检测? 标本来源丰富，细胞不需培养，间期细胞，分裂 中期细胞、分化或未分化细胞及死亡或存活的细 胞皆可以被检测? 可与多种技术结合（细胞形态学、免疫学、流式 细胞术），可回顾性分析,可确定恶性细胞的克隆 起源或鉴别良恶性细胞第6页/共46页 FISH技术的局限性? 异常检测取决于能否获得相应探针? 三体检测敏感性高于单体或缺失? 骨髓、外周血标本较实体瘤、石蜡切片好处理? 不能检测全基因组异常（间期FISH）第7页/共46页 FISH主要仪器? FISH分析工作站（荧光显微镜、分析照相软件）? 荧光原位杂交仪? 恒温水浴槽? 高速离心机? 培养箱? 微量加样器pH仪第8页/共46页 FISH技术比较FISHSKY M-FISHRX-FISHCGHaCGH全染色体扫描×√√√√平衡易位√√部分××不平衡易位√√部分√√倒位√×部分××缺失√×部分√√扩增√部分√√√非整倍体√√√××分辨率1-10 kb2-10 Mb2-10 Mb3 Mb10-100kb第9页/共46页 FISH探针种类着丝粒探针位点探针涂染探针第10页/共46页 双色单融合探针第11页/共46页 额外信号探针第12页/共46页 双色双融合探针第13页/共46页 正常异 常第14页/共46页 双色分离探针第15页/共46页 数量、位点探针第16页/共46页 人类细胞遗传学命名第17页/共46页 ? nuc ish(CEP8×2)[400]nuc ish(BCR,ABL)×2[400]nuc ish(BCR,ABL)×3,(BCR con ABL×2)[380/400]nuc ish(MLL×2)[400]? nuc ish(MLL×2)(5’MLL sep 3’MLL×1)[100/200]? nuc ish(CEPX×2)[2]//(CEPX,CEPY)×1[398]第18页/共46页 A: nuc ish(ABL,BCR)×2B: nuc ish(ABL ×2,BCR ×3)ABLBCRAABLBCRB第19页/共46页 A: nuc ish(ABL,BCR)×3(ABL con BCR×2) B: nuc ish(ABL,BCR)×4 (ABL con BCR×3)C: nuc ish(ABL ×3,BCR ×2) (ABL con BCR×1)ABLBCRBBCRABLACABLBCR第20页/共46页 TELAML1A: nuc ish(TEL×2,AML1×3)(TEL con AML1×1) B: nuc ish(TEL×1,AML1×4)(TEL con AML1×1) C: nuc ish(TEL×2,AML1×5)AML1TEL/AML1AAML1TELBC第21页/共46页 ABCD5S721D5S721D5S721EGR1EGR1EGR1A: nuc ish(D5S23/D5S721×1,EGR1×1) B: nuc ish(D5S23/D5S721×2,EGR1×1) C: nuc ish(D5S23/D5S721×3,EGR1×1)第22页/共46页 质量控制第23页/共46页 质量管理内容? 商品探针、自配试剂验证? 标准化流程及规范化操作（前处理、实验操作）? 规范判读标准? 建立本实验室判读阈值? 建立临床生物参考区间第24页/共46页 FISH操作流程? 样本制备：细胞、骨髓、外周血、组织等? 制片： 细胞悬液滴片或石蜡组织切片? 预处理： 2×SSC