利用基因工程技术表达蛋白质.pptxVIP

第四章 利用基因工程技术表达蛋白质本章的重点内容：1. 什么是基因工程？2. 获得目的基因的方法有哪些？3. DNA双脱氧测序技术的基本原理。 4. PCR技术的基本原理及其应用。5. 基因定点突变技术及其应用。6. 表达载体的构建策略与技术方法。 7. 如何根据蛋白质氨基酸序列获得其基因？第1页，共53页。第一节 基因工程原理简介一、基因工程的定义 本义：根据人们的意愿，利用工程设计的方法，在体外将克隆获得的目的基因与适当的载体进行切割和连接，构建成正确的重组表达载体，再应用物理的、化学的或生物学的方法将该表达载体导入到细菌、动植物细胞或受精卵中，使目的基因在宿主体内以瞬时方式或稳定方式进行表达，借此研究目的基因的结构与功能，或获得该基因的表达产物。这一过程就是基因工程。 广义：转基因动物；克隆；基因打靶；基因组计划等均属于基因工程的范畴。第2页，共53页。二、基因工程的基本步骤目的基因获得表达载体构建基因的导入整合与表达的鉴定表达产物的提取、纯化与鉴定第3页，共53页。第二节 基因工程中的方法学一、基因工程的基本技术（一）无菌操作技术（二）核酸的提取纯化 1. RNA提取纯化技术； 2. DNA提取纯化技术； 3. plasmid提取纯化技术。（三）核酸电泳技术 1. 琼脂糖凝胶电泳 2. SDS（四）感受态细胞的制备与转化第4页，共53页。真核细胞总RNA的电泳结果：第5页，共53页。 1 2 3 4 51 DL2000 marker2 BamHI和EcoRI双切3 BamHI单切4 HindⅢ单切5 重组质粒pVAX1/ABPS120001000750500200100核酸电泳技术 1. 琼脂糖凝胶电泳2. SDS第6页，共53页。二、一些重要技术原理介绍 重点介绍DNA双脱氧测序技术，核酸探针技术，PCR技术等。（一）DNA双脱氧测序 第7页，共53页。第8页，共53页。第9页，共53页。第10页，共53页。第11页，共53页。(二)核酸杂交技术（probe） 1）原理； 2）标记物； 3）种类； 4）应用 第12页，共53页。1. Dot blot第13页，共53页。2. Southern blot： DNA第14页，共53页。3. Northern blot: RNA第15页，共53页。Western blot:Protein第16页，共53页。（三）PCR技术 1.基本原理 2.引物设计 1)长度; 2)GC%; 3)stem-loop; 4)dimer; 5)错配; 6)5’末端可以不配对 3.应用: 科学研究；医学与兽医临床。Kary B. MullisLa Jolla, CA, USA. B.1944第17页，共53页。DNA生物合成与PCR方法合成DNA的异同点:1.相同点：均为酶促反应；均需要模板和引物；底物为dNTP； 半保留复制；均为5’ 3’方向复制。2.不同点：1）反应条件不同：体内为生理条件，体外为94℃、52℃及72 ℃ 等变温条件；2）参与反应的物质种类和数量不同；3）引物不同，体内为RNA，体外为DNA，且在DNA合成后，前者 被切除掉，后者作为终产物的一部分；4）体内为半不连续合成，体外为连续合成；5）体内单复制原点或多复制原点，单方向或双方向复制；6）体内受细胞周期的调控，体外按人们的意愿进行；7）体内具有校正、修复的功能（错配率较低），体外无（错配 率较高）；8）体内DNA的复制为全部染色体DNA的复制，体外仅复制两引物 之间的DNA序列。第18页，共53页。（四）目的基因的改造技术 1. 引物介导的基因定点突变技术 2. 盒式突变(cassette mutagenesis) 3. Genes Shuffling第19页，共53页。三、基因工程中的工具（一）载体 1.质粒(plasmid) 2.粘粒(cosmid) 3.λ噬菌体(λ phage)（二）工具酶 1.限制性内切酶 2.外切酶 3.连接酶 4.聚合酶: klenow I 5.核酸酶（三）宿主菌 DH5?, JM101, JM109; DE3等第20页，共53页。第21页，共53页。四、获得目的基因的方法 基因文库（基因组文库和cDNA文库），化学合成，PCR 等方法。还有DD-PCR以及基因芯片等技术。（一）基因组文库 目的：种质资源的保护；基因组测序；基因组基因或调控序列的克隆等。第22页，共53页。 家蝇卵黄蛋白基因组基因的克隆和序列分析 第23页，共53页。文库液噬菌斑可疑阳性克隆阳性克隆特异性探针转化三次纯化噬菌斑原位杂交噬菌斑原位杂交KW251提 取 目的DNA片段λ-DNA 鉴