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生物学DNA克隆技术;第二章  DNA克隆技术;1、克隆： ——无性繁殖 一种无性繁殖技术。指由一个细菌和细胞，通过分裂繁殖所产生的一系列遗传结构完全相同的群体。;克隆羊： 个体水平 细胞克隆： 细胞水平 DNA克隆： 分子水平 单克隆抗体： 分子水平;卵细胞;2、DNA重组/ 基因重组;3、DNA克隆/ 基因克隆/ 分子克隆;4、基因工程;遗传学角度：一项遗传学技术;第10页/共171页;生物化学角度：重组载体的操作;二、应用：;第一节 概论;The transforming principle is DNA.;Francis H. Crick James D. Watson ;History of DNA cloning;中 心 法 则; 质粒（Plasmid）是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子（即细胞附殖粒、又胞附殖粒）。大部分的质粒都是环状构形。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。它是基因工程最常见的运载体。;限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶。根据限制酶的结构，辅因子的需求切位与作用方式，可将限制酶分为三种类型，分别是第一型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。Ⅰ型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。III型限制性内切酶同时具有修饰及认知切割的作用。;History of DNA cloning;Recombinant DNA Technology Boyer and Cohen, 1973;二、基因克隆的特点和技术路线;基因克隆技术路线;3、基本原理;第二节 工具酶;重组DNA技术中常用的工具酶;一、限制性内切酶 1、定义 内 切：在双链DNA内部切割 限制性：识别特异序列，在特异位点切割 ------GAATTC------ ------CTTAAG------ EcoRⅠ酶切位点;2、命名 酶的来源 Haemophilus influenzae d 属名 种名 株系 酶的名称 Hind Ⅰ 特异性甲基化酶 Ⅱ GTPy PuAC Ⅲ A AGCTT;3、分类 Ⅰ Ⅱ Ⅲ DNA底物 双链DNA 双链DNA 双链DNA 辅因子 Mg2+ ATP SAM Mg2+ Mg2+ ATP 识别序列 特异 特异 特异 切割位点 非特定 特定 特定 识别序列前后 之中 之后25bp~27bp 100-1000bp 修饰作用 有 无 有 ;4、特点 Ⅱ型限制酶： 4~8个核苷酸 切口概率 星号活力 回文结构 平端切口 粘性末端 ;如EcoRI切割后产生5′末端突出的粘性末端； 5′－G↓AATT C－3′ 5′－G-OH p-AATTC－3′ 3′－C TTAA↑G－5′ 3′－CTTAA G－5′ PstI切割后产生3′末端突出的粘性末端： 5′－C TGCA↓G－3′ 5′－CTGCA-OH p