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综合性实验植物DNA的提取及电泳 本科学生综合性实验报告 学号： 124120434 姓 名： 刘云谣 学院： 生命科学学院 专业、班级： 12生物技术 实验课程名称：植物DNA提取质量检测及特定基因片段操作 教 师： 郝大海 开 课 学 期： 2014 至 2015 学年 上 学期 云南师范大学教务处编印 三、实验设备及材料 （一）、仪器设备 1.5ml离心管；5ml离心管；研磨棒；5ml吸头；1000ul吸头（盒）；200ul吸头（盒）；10ul吸头（盒）；5ml移液器；1000ul移液器；200ul移液器；30ul移液器；2ul移液器；试剂瓶；量筒、恒温水浴锅；高速离心机；紫外分光光度计；电泳仪；电泳槽；酸度计；电子天平；PCR仪 （二）、试剂 CTAB；NaCl；Tris；HCl；H3BO4；EDTA；NaOH；PVP；琼脂糖；EB；引物；dNTP；Taq酶；EB （三）、材料：马铃薯叶 四、实验方法步骤 （一）、DNA的提取； 1、取100mg新鲜叶片，置于预冷1.5ml离心管中，加入液氮，研为细粉。加入350μl新鲜2×CTAB缓冲液，再仔细研磨。（CTAB用于抽提DNA） 2、350μl新鲜2×CTAB缓冲液，冲洗研磨棒，加入2μlβ－巯基乙醇，混匀。65℃水浴45分钟，每15分钟摇动一次。冷却至室温，静置2分钟。 3、每支离心管加入700μl氯仿：异戊醇（24：1）（672氯仿:28异戊醇）混合液。轻柔短暂地混和，避免DNA断裂。颠倒几次。（氯仿、异戊醇、苯酚都用于沉淀蛋白质） 4、在微型离心机中，以14，000rpm离心5分钟。移取上层水层，置于新的、标识好的1.5ml离心管中。注意避免取到中层物质。将氯仿：异戊醇废液倒入废液缸。 5、加入50μl 10％CTAB（溶于0.7M NaCl），轻柔混和，并保证混和完全。 6、重复第3、第4步。 7、每支离心管中加入等体积异丙醇（400－500μl）。上下颠倒几次，4℃静置20分钟（或－20℃，15分钟）。（异丙醇用于沉淀DNA） 8、14，000rpm离心20分钟。小心倒出上清夜，避免DNA颗粒丢失。倒置离心管，空气干燥（1－2分钟）。 9、用1ml70％乙醇清洗DNA（3分钟），14,000rpm离心30分钟。小心倒出70%乙醇，用1ml 90％乙醇清洗DNA，14,000rpm离心30分钟，小心地倒去乙醇。倒置离心管，空气中干燥，或用真空泵干燥15分钟。（乙醇用于去除低分子量寡核苷酸和核苷三磷酸） 10、以150μl T10E1或蒸馏水溶解DNA，加入1～2μl不含DNA酶的RNA酶A（10mg/ml）。37℃反应1小时。 11、4℃保存（－20℃长期保存）。 （二）、琼脂糖凝胶电泳 1、取5×TBE缓冲液20mL加水至100mL，配制成1×TBE稀释缓冲液，待用。 2、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，置于200mL锥形瓶中，加入50mL 1×TBE稀释缓冲液，放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为1％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。 3、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。 向冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5μg /mL。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入1×TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。 4、加样：取10μL DNA样品与2μL 6×上样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。 5、电泳：加完样后,合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。 6、染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/mL的EB溶液中，室温下染色20-25min。 7、观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。 五、实验注意事项 1、EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手