流式细胞术应用技巧.pptxVIP

流式细胞术应用技巧;流式细胞仪应用技巧; 　 利用流式细胞仪( flow cytometer ) 通过检测荧光信号来检测细胞或其它颗粒性物质（表面或胞浆或胞核）的物理、化学特性并通过这些特性对细胞或颗粒进行 定量。 检测表面标记物 检测胞浆标记物 检测胞核内标记物 检测可溶性蛋白;光源： 激光(488nm 氩离子空冷激光) 细胞： 单细胞悬液 液流： 鞘液(Sheath Fluid) 流动室： Flow Cell 检测器： 光电倍增管(PMT) 检测信号： 散射光(FS，SS)，荧光信号(FL1~FL4) 统计分析： 计算机;散射光信号 FS 细胞大小 SS 细胞颗粒性 荧光信号 FL1 – FITC FL2 – PE FL3 – ECD FL4 – PC5 FL5 - PC7; 用荧光标记抗体;2、标本处理原理（标记原理）;间接免疫荧光标记法;直接免疫荧光标记法;抗原分布:Important for method optimization;Intracellular Cytokine-Protocol;2、提供的信息;第13页/共74页;二、流式细胞仪的应用技巧一;白血病全过程评价;CIK细胞治疗过程的评价;第17页/共74页;肿瘤细胞免疫特点;AIDS全过程免疫细胞评价;骨髓移植或CD34细胞移植;第21页/共74页;第22页/共74页;凋亡启动;第24页/共74页;三、流式细胞仪的应用技巧二;1、CIK细胞作用肿瘤细胞的凋亡分析 2、不同细胞的转染、表达情况 3、不同分型增殖的细胞分布 4、sp细胞、非sp细胞 ;5、肿瘤细胞诊断时 （1）、胸腹水：把白细胞和癌细胞分开 （2）、穿刺，手术细胞： ;第28页/共74页;第29页/共74页;第30页/共74页;四、流式细胞仪的应用技巧三;1、质粒转染中： 转染率 疫苗 转染的强度 2、同时分析转染率和转染强度 3、稀有细胞的额外发现： T亚期中：CD45+、CD3+、CD4-、CD8- NK细胞：CD3-CD16+56+ CD3+CD16+56+ 4、Tunecl方法中 不同周期的凋亡状况 细胞阻滞状况 DNA断片发生时SOS状况;;第34页/共74页;第35页/共74页;五、流式细胞仪的应用技巧四;;荧光显微镜下经丫啶橙/溴化乙啶染色;SGC-7901细胞24h;ECV-304细胞 24h;第41页/共74页;六、流式细胞仪的应用技巧五;免疫细??相对绝对计数 造血干细胞和其他稀有细胞的检测 血小板活化、膜糖蛋白及抗体检测 DNA倍体分析，周期、异倍体分析 细胞内因子（Th1/Th2） 细胞因子（体液及培养液因子） 各种凋亡检测（Apo.2.7 Tunecl、DNA亚二倍体） 组织中免疫细胞和其他细胞（如CXCR、CCR） 基因蛋白检测（如p53、Bcl-2等） 白血病免疫分型 B27检测 动物检测过程中的问题;免疫细胞的检测 ; 1、标准方案 抗 凝 血 组 织 胸腹水、灌洗液（单细胞悬液）;2、可能的问题及解决办法 （1）、标本环节 抗凝血： A、抗凝效果不好：如果没有大的凝血块，该血可以使 用，但结果可能受影响。设阈值时最好采用Fl1 （CD45所在）;如果有大的凝血块，不能用于检测。 B、标本在4℃或以下放置过：一般不做检测用。 C、标本放置时间大于48小时：检测时尽量用Fl1设阈值。 建议：最好使用新鲜标本检测，尤其是做绝对计数时。 D、动物血：对于猪、猴、兔、狗等大动物的，如人一样 处理。而如小白鼠等小动物，由于所采血量少，需要 先溶血，后加样处理。如需做绝对计数，则要求计算 稀释倍数，比如10ul血加入490ul溶血素相当于稀释了 350倍。 ;2、可能的问题及解决办法 组织标本： 组织标本做免疫细胞时，通常需要