5种致泻大肠埃希氏菌实时荧光定量PCR快速检测技术.pdfVIP

5种致泻大肠埃希氏菌实时荧光定量PCR快速检测技术--第1页 5种致泻大肠埃希氏菌实时荧光定量 PCR快速检测技术 王芳妹;钟文涛;王淑好;卢琳;韩奉玲 【摘要】将 5 种致泻大肠埃希氏菌的毒力基因保守序列进行设计并合成了引物和 探针,建立的多重实时荧光 PCR 4 种试剂盒可以同时检测 5 种致泻大肠埃希氏菌.结 果表明:4 种试剂盒的 12 对毒力基因通过 5 种致泻大肠埃希氏菌的标准储备菌株均 得到验证;并且 12 对毒力基因只对对应的致泻大肠埃希氏菌特异性起作用,对常见 的食源性致病菌都无扩增曲线;escV、bfpB、stx 1、ipaH 和 invE 基因的检出限是 10 CFU/mL,aggR 基因的检出限是 102 CFU/mL,astA 和 pic 基因的检出限是 103 CFU/mL,而 stx 2 A、ipaH 和 stIb 基因菌液浓度 10 CFU/m 时,均可观察到明显 的\S\型扩增曲线,且线形较好;并且对抽查和委托检验的肉类、奶和动物腹泻物以 及人工污染样品等 40 份样品进行检测,共检出 11 份阳性样本,与 GB 4789.6— 2016 标准检测结果相一致,表明建立的 4 种试剂盒方法具有良好的实用性. 【期刊名称】《食品与机械》 【年(卷),期】2019(035)005 【总页数】8 页(P88-95) 【关键词】致泻大肠埃希氏菌;实时荧光定量 PCR;毒力基因 【作者】王芳妹;钟文涛;王淑好;卢琳;韩奉玲 【作者单位】湖南省产商品质量监督检验研究院,湖南 长沙 410007;湖南师范大学 生命科学学院,湖南长沙 410081;湖南师范大学蛋白质化学与发育生物学教育部重 点实验室,湖南 长沙 410081;湖南省产商品质量监督检验研究院,湖南 长沙 410007; 5种致泻大肠埃希氏菌实时荧光定量PCR快速检测技术--第1页 5种致泻大肠埃希氏菌实时荧光定量PCR快速检测技术--第2页 湖南省产商品质量监督检验研究院,湖南 长沙 410007;湖南省产商品质量监督检验 研究院,湖南 长沙 410007;湖南省产商品质量监督检验研究院,湖南 长沙 410007 【正文语种】中 文 致泻大肠埃希氏菌是一类能引起人体腹泻的食源性病源微生物。由于致泻性大肠埃 希氏菌相同的基因片段内保守区很相似，检测单一基因片段特异性并不高，难以确 认或排除致泻性大肠埃希氏菌感染，很容易造成漏检[1-3]。因而 5 种致泻性大肠 埃希氏菌的检测方法的灵敏度和准确性对预防和控制由其引起的腹泻有着十分重要 的作用。 在新标准(GB 4789.6 2016)发布之前采用的检测方法主要是从分离培养、生化试 验鉴定、血清试验和肠毒素试验进行鉴定 [4-6] ，该传统检测方法简单易行、费用 低，但周期长，所用的试剂和血清要求严格 [7] ；对于那些致病菌含量很低且生化 特征与普通大肠埃希氏菌相似的病原体，很难挑出真正的目的菌，也可能因为杂菌 增长速度过快不易检出目的菌。2016 年发布的 GB 4789.6 2016 《食品安全国 家标准 食品微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验》中明确要求，在常规微生物检 测的基础上必须要根据分子生物学中的 PCR 技术进行确认试验，此方法很好地解 决了传统方法中检测特异性不高，耗时较长、操作较繁琐等问题，但该方法对人员 专业技术要求较高，试验试剂溴化乙啶对检验人员的身体健康危害十分严重，并且 在开盖操作时会增加气溶胶污染的可能性，造成假阳性的产生，难以根除 [8-10]。 实时荧光定量 PCR 技术中的 TaqMan 法对目标序列具有较高的特异性，结果重复 性也比较好，引物和探针的设计相对比较简单，因此该方法已广泛应用于分子生物 学研究中。PCR 技术的应用十分广泛，已从扩增单一基