水稻瘤矮病毒部分基因组片段克隆及序列分析.pptxVIP

第1页/共41页水稻瘤矮病毒部分基因组片段克隆及序列分析第2页/共41页 水稻瘤矮病毒部分基因组片段的克隆及序列分析第3页/共41页研究概况--传统生物学分类地位 水稻瘤矮病毒（Rice gall dwarf virus, RGDV）属于呼肠孤病毒科植物呼肠孤病毒属的成员之一。与三叶草伤瘤病毒（Wound tumor virus, WTV）、水稻矮缩病毒（Rice dwarf virus, RDV）和水稻簇矮病毒(Rice bunchy stunt virus, RBSV)同属一类病毒。 分布 1980年首次泰国发现，随后马来西亚、日本、韩国和中国的广东、广西也有报道。福建的云霄、诏安已有零星分布。 第4页/共41页研究概况--传统生物学危害 广东省信宜市发病率一般在1%-5%，重者30%以上，水稻严重减产。重病田减产4500公斤/公顷，甚至失收。 症状 矮缩，叶背和叶鞘上长出 2×0.5mm淡黄绿色小瘤。传毒介体及传毒特性第5页/共41页研究概况--传统生物学病毒粒体 呈三重对称的二十面体结构，直径大约65nm--70nm。病毒粒体在水稻和昆虫介体中的定位水稻: 韧皮部细胞的细胞质和液泡以及从韧皮部细胞长出的瘤细胞中；昆虫介体: 多种细胞的细胞质中。第6页/共41页研究概况--传统生物学血清学 RGDV蛋白组分的分子量和分布第7页/共41页研究概况--传统生物学发病规律及防治措施 主要为害晚稻，尤以杂优稻受害重；早稻受害较轻，是晚稻的主要侵染源。晚稻播种后从秧针期开始即受侵染，早播早植比迟播迟植发病重，9叶龄后感染的不发病。 控制初侵染源和杀灭传毒介体。第8页/共41页研究概况--分子生物学RGDV RDV基因组包含12条线形超螺旋双链RNA片段，总分子量大约1.428×107或1.692×107。反向重复序列S2S3S5 特异性末端保守序列S8S95’ GGCAUUUU--/GGUAUUUU--/GGUAAUUUUGAU 3’S10S11 10%的SDS第9页/共41页 研究概况--分子生物学 RGDV-T部分基因组组织状况第10页/共41页本项目研究的目的及意义理论意义1. 国外只完成RGDV-T部分基因组片段的序列测 定及功能分析，许多基因功能尚未明确；国内RGDV的分子生物学方面还属空白。 2. RGDV界于RDV与WTV之间，且既能在寄主植物又能在介体昆虫的组织或细胞中复制，是研究植物呼肠孤病毒属病毒的起源与进化以及病毒—介体—宿主之间关系的模式对象。第11页/共41页本项目研究的目的及意义现实意义 病区发病重，有进一步蔓延趋势，对南方稻区具有潜在危害，因此有必要对其基因组结构及功能进行研究。第12页/共41页材料与方法（一）材料RGDV中国广东信宜分离物（RGDV-C）采自广东省信宜市感病的水稻（2002年9月），采集的病株种植于防虫网室，病叶保存在-70℃冰箱中 其他试验材料第13页/共41页材料与方法（二）方法CF-11纤维素柱 RT-PCR单引物扩增技术分析软件第14页/共41页材料与方法（三）克隆策略 5’3’SefSabScd覆盖RGDV基因组S2和S3片段全长的RT-PCR扩增策略 第15页/共41页材料与方法（四）单引物扩增技术路线第16页/共41页结果与分析--提取纯化 RGDV-dsRNA的电泳 A:1%琼脂糖凝胶 B:10%的SDS、6、7 RDV基因组；2~5 RGDV基因组 第17页/共41页结果与分析--同源克隆 1. S2片段扩增及酶切 1 2 3 M 4 5 6 M 7 8 M1.5kb1.1kb0.9kb PCR扩增及重组克隆子的酶切分析M, λDNA cleaved with HindⅢ/EcoRⅠ ；1，S2ab段扩增产物；2~3，S2ab段重组克隆子的双酶切；4，S2cd段扩增产物；5~6，S2cd段重组克隆子的双酶切；7，S2ef段扩增产物；8，S2ef段重组克隆子的双酶切。第18页/共41页结果与分析--同源克隆 2.全序列分析 3514bp,与RGDV-T核苷酸长度相等，同源性为97.1%; 有一个长的ORF，由第14位核苷酸开始延伸至3460位核苷酸，编码一个由1148个氨基酸残基组成的多肽，分子质量约127kDa，与RGDV-T氨基酸同源性为98.7% 。 第19页/共41页结果与分析--同源克隆 1. S3片段扩增及酶切 1 2 3 M 4 5 6 M 7 8 9 1.1kb1.5kb0.75kbPCR扩增及重组克隆子的酶切分析M, λDNA cleaved with HindⅢ/EcoRⅠ ； 1