流式细胞术的样品制备.pptxVIP

流式细胞术的样品制备; FCM的样品制备包括单分散细胞悬液制备技术，细胞生物学特征标记技术及荧光染色技术，FCM是对细胞或细胞器的结构和某些功能进行定量测定，并可以根据细胞亚群的特点性质对其进行分类的技术。 FCM的实验对象是单细胞或单细胞核的悬液，在FCM技术中制备出合格的单细胞悬液是非常重要的环节，这些单细胞悬液主要来源于单层细胞、血液、脱落细胞、实体组织及石蜡包埋组织等。; 一、单层培养细胞分散为单个细胞 ㈠贴壁的单层培养细胞单细胞悬液的制备 操作步骤： 1、将单层培养细胞(对数生长期)中的旧培养液倒掉。 2、加入少量0.25%胰酶，消化细胞，在倒置显微镜下观察，见细胞稍变圆时，立即终止消化（假如含有10%胎牛血清的培养基），收集细胞，离心后去上清，PBS液洗涤细胞一次，离心去掉上清液，约留0.5ml细胞悬液，用振荡器使细胞分散。 3、如果不是及时上机检测，则需要对细胞进行固定，常规固定液为70%乙醇，然后保存于4℃冰箱中。;（二）悬浮培养细胞单细胞悬液的制备 操作步骤： 1、离心去除旧培养液，PBS液洗涤细胞一次，离心去掉上清液，约留0.5ml细胞悬液，用振荡器使细胞分散。 2、如果不是及时上机检测，则需要对细胞进行固定，常规固定液为70%乙醇，然后保存于4℃冰箱中。; 二、实体组织单分散细胞的制备 ㈠新鲜实体组织 新鲜实体组织是手术或活检后根据检测目的而采取的样品，此样品应及时进行适当的保存处理，如及时用固定剂或低温对组织进行保存，以避免由于室温过高、放置时间过长而造成组织自溶，影响检测结果。;新鲜实体组织单细胞悬液制备方法如下： ⒈酶消化法 ⒉机械法 ?剪碎法 ?网搓法 ?研磨法 ⒊化学试剂处理法 ; ⒈酶消化法 酶对实体组织分散作用原理主要有三方面： ﹡一是可以破坏组织间的胶原。 ﹡二是可以水解组织细胞的紧密连结装置的蛋白性物质。 ﹡三是可以水解组织间的粘多糖物质。 酶消化法是实体组织分散为单细胞的主要方法，常用的酶类试剂有： ? 蛋白酶类，(如胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，链蛋白酶和中性蛋白酶等)都能够释放所有组织中的细胞； ? 胰酶，能水解脂键和肽键； ? 胶原酶，能降解几种分子类型的胶原； ? 溶菌酶，能水解糖蛋白和肽的糖苷键； ? 弹性蛋白酶，能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维，可用于解离血管、心脏和肝脏的细胞。; 为使组织细胞分散下来，应用酶学方法必须注意条件的选择和影响因素： ※ 酶需要溶解于适当的溶液中，而这种溶液不致于造成 酶效价降低 ※ 注意组织在消化液中的消化时间 ※注意酶活性的PH值 ※ 注意酶的适用浓度 ※ 随时注意影响酶活性的其他因素 各种酶的分散程度都有一定的限制性，特别是在进行免疫标记实验时，酶处理可能改变细胞膜的成分，从而影响细胞亚群的区分。应指出，用于组织分散的很多酶是不够纯的，不仅含有一种占主导的酶，而且在不同程度上也混有其他污染物质，它们的活性可能有利于组织分散，也可能对组织的结构或功能产生不利的影响。;酶学方法的一般程序： ①将适合于酶消化的组织置于离心管中。 ②将选好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化组织的试管中。 ③一般消化20-30分钟(恒温37oC或室温)，消化期间要间接振荡或吹打。 ④终止消化，收集细胞悬液，以尼龙网(200目)过滤，除去大团块，以低速离心除去细胞碎片。 ⑤将制备好的单细胞进行流式细胞术分析或保存。; ⒉机械法 机械法分裂实体组织包括：用剪刀剪碎或用锋利的解剖刀剁碎，用匀浆器匀浆，用细注射针头抽吸细胞以分散细胞，采用网搓法同样也能获得大量的细胞，机械法易造成细胞悬液中细胞碎片，所以机械法常与其他方法配合使用。;常用的几种机械法制备过程如下： ?剪碎法： ①将组织块放入平皿中，加入少量的盐水。 ②用剪刀将组织剪至匀浆状。 ③加入10ml生理盐水。 ④用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管中。 ⑤离心沉淀1000prm3-5分钟，再用生理盐水洗三次，每次以短时低速离心沉淀(500-800prm)去除细胞碎片。 ⑥以300目尼龙网过滤除去细胞团块。 ⑦70%冰乙醇固定，放入4℃冰箱。 ;?网搓法： ①将100目铜网扎在小烧杯上。 ②把剪碎的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边用生理盐水冲洗，直到将组织搓完。 ③用300目的尼龙网过滤细胞悬液除去大的团块 ④收集细胞悬液，离心沉淀1000prm，5分钟。 ⑤70%乙醇固定，置4℃冰箱备用。