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K562-4-1BBL-MICA工程细胞构建及其联合 一、K562-4-1BBL-MICA工程细胞的构建 K562是人体慢性髓性白血病细胞系，因其细胞表面缺少HLA类分子，适合作为搭档细胞进行NK细胞扩增。4-1BBL是一种共刺激分子，能够激活NK细胞，并提高其活性。MICA分子是一种具有重要生物学功能的NKG2D配体，能够被NK细胞活化，促进NK细胞介导肿瘤细胞溶解。因此，将4-1BBL和MICA合并到K562细胞表面可以增强其作为细胞疫苗的效果，引发更强烈、持久的免疫反应。 K562-4-1BBL-MICA工程细胞的构建需要以下步骤： 1. 选择启动子和质粒：应根据需要选择适合的启动子和质粒，使4-1BBL和MICA基因的表达到达最优状态。常用启动子包括CMV、EF1α、PGK等；质粒则包括pCDH、pLVX、pTRIPZ等。本实验中选用CMV启动子和pCDH质粒。 2. 克隆人类4-1BBL和MICA基因：将人类4-1BBL和MICA基因克隆入质粒中。在选取适当的限制性内切酶将两个基因插入同一个质粒中时，较好的方法是先将4-1BBL基因克隆入质粒中，然后再克隆MICA基因。在MICA基因的最5端添加一个带有限制性内切酶位点的引物，从而可以将MICA基因插入到4-1BBL基因的末端，两个基因通过一个碱基骨架连接在一起。 3. 转染K562细胞：将构建好的质粒转染到K562细胞中，可以采用常见的电穿孔法、化学法或热激法等。转染后将细胞放入培养基中，进行稳定的筛选和扩增。 4. 检测4-1BBL和MICA的表达：利用实时荧光定量PCR和ELISA等方法检测表达4-1BBL和MICA基因的细胞。 二、K562-4-1BBL-MICA工程细胞的应用 K562-4-1BBL-MICA工程细胞的应用主要是作为NK细胞扩增的搭档细胞和细胞疫苗。下面介绍一些它的应用情景： 1. NK细胞扩增：将K562-4-1BBL-MICA工程细胞与人外周血单个核细胞共培养数天，可以大量扩增出NK细胞，并提高其活性。因为MICA和4-1BBL分子能够活化NK细胞，因此K562-4-1BBL-MICA细胞比起纯K562细胞更适合作为搭档细胞进行NK细胞扩增。 2. 细胞疫苗：将K562-4-1BBL-MICA工程细胞用于免疫治疗时，能够诱导宿主免疫细胞对于患者的肿瘤产生抗体，从而阻止恶性细胞的生长转移。其原理是，K562细胞可产生注意到肿瘤的抗原，加上在细胞表面表达4-1BBL分子和MICA分子诱导NK细胞与肿瘤细胞结合，产生细胞毒作用，从而诱导机体产生强烈的免疫应答。 3. 免疫治疗：K562-4-1BBL-MICA工程细胞可以用于终末癌症等细胞治疗策略中，并且能够产生比单一的基因转染K562细胞更为有效的结果。该方法与采用借助外源的免疫介导治疗相比具有较高的生物合理性和可控性，其抗癌效果将在临床实验中得到评估。