农业农村部公告第323号-9-2020CN.docx

ICS 65.020.01 B 04 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 农业农村部公告第323号—9—2020 转基因植物及其产品成分检测 环介导等温扩增方法制定指南 Detection of genetically modified plants and derived products— Guid elines for establishing loop-mediated isothermal amplification method 发布2020-08-04 2020-11-01实施 发布 亚 中华人民共和国农业农村部发布 I 农业农村部公告第323号—9- 2020 前 言 本标准按照GB/T1.1—2009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国农业转基因生物安全管理标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：农业农村部科技发展中心、上海交通大学、中国农业科学院生物技术研究所 本标准主要起草人：杨立桃、王颢潜、宛煜嵩、章秋艳、张大兵、宋贵文。 1 农业农村部公告第323号—9—2020 转基因植物及其产品成分检测 环介导等温扩增方法制定指南 1 范围 本标准规定了转基因植物及其产品成分检测的环介导等温扩增方法制定的要求和程序。 本标准适用于转基因植物及其产品成分检测的环介导等温扩增方法的制定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 农业部2259号公告—4—2015 转基因植物及其产品成分检测 定性 PCR 方法制定指南 农业部2259号公告 — 5 2015 转基因植物及其产品成分检测 实时荧光定量 PCR 方法制定指南 NY/T 672 转基因植物及其产品检测 通用要求 3 术语和定义 NY/T 672、农业部2259号公告 — 4 2015、农业部2259号公 2015界定的以及下列术语和定 义适用于本文件。 3.1 环介导等温扩增方法 loop-mediated isothermal amplification,LAMP 利用序列特异性引物，在具有链置换活性的 DNA 聚合酶(Bst DNA polymerase)作用下，在最优温度 条件下(60℃~65℃)对靶序列进行恒温非线性化扩增的一种方法。 4 要求 4.1 转基因植物环介导等温扩增方法的制定单位应是具备条件和能力的技术机构。 4.2 转基因植物环介导等温扩增方法的制定单位应具备开展转基因生物检测工作所需的仪器设备和环 境设施。 4.3 转基因植物环介导等温扩增方法的研制人员应具备转基因生物检测相关业务知识。 5 技术路线 根据拟制定的标准方法的目的，制定标准方法研制的技术路线。技术路线主要包括方法建立和实验 室间验证等内容，如图1所示。 6 方法建立 6.1 实验材料选择 根据方法扩增的靶序列的类型，如筛选检测方法、基因特异性检测方法、构建特异性检测方法、转化体 特异性检测方法等，选择合适的实验材料用于检测方法的建立。实验材料至少应包括： a) 含有靶序列的转基因植物及其加工产品； b) 不含靶序列的转基因植物； c) 不含靶序列的非转基因植物。 6.2 技术参数确定 6.2.1 靶序列选择确认 2 农业农村部公告第323号—9—2020 环介导等温扩 环介导等温扩 增方法制定 方法建立 方法灵敏度测 试和表述 实验室间验证 样品设计 验证项目 结果分析 方法再现性 测试 方法特异性 测试 实验材料选择 技术参数确定 图 1 标准方法研制的技术路线 根据预期拟制定的方法，选择合适的转基因外源插入序列、转化体特异性序列和内标准基因，通过文 献检索、测序及序列比对等方式，确定等温扩增的候选靶序列的正确性。 6.2.2 引物设计和筛选 环介导等温扩增引物的设计一般由内侧和外侧2对引物和/或第3对环引物组成。 环介导等温扩增的靶序列长度一般为150 bp～250 bp。 环介导等温扩增引物的设计可以用专业软件设计完成。 筛选的引物应保证其对靶序列具有严格的特异性扩增和符合要求的检测灵敏度。 6.2.3 反应体系和反应程序确定 环介导等温扩增反应体系生化和化学试剂组成相对固定，但各成分之间的比例可以根据靶序列 和引物进行优化。