HBVDNA定量及变异检测的临床应用.pptxVIP

HBVDNA定量及变异检测的临床应用;一、HBV病毒介绍;;图2.2006年统计乙肝病毒携带者分布范围;2.乙肝病毒生物学特性 ; 外壳：前S1抗原，S1抗原，S2抗原等； 核心：基因组，核心蛋白，DNA聚合酶等；;图4.乙肝病毒模式图;HBV DNA负链有四个开放区，分别称为S、C、P及X(图26-2)，能编码全部已知的HBV蛋白质。S区可分为二部分，S基因和前S基因。S基因(核苷酸155～833)能编码主要表面蛋白。S基因之前是一个能编码163个氨基酸(2，848-154)的前S基因，编码Pre S1和Pre S2蛋白。C区基因包括前C基因和C基因，分别编码HBeAg和HBcAg。P区最长，约占基因组75%以上，编码病毒体DNA多聚酶。X区(核苷酸1，374～1，835)可能编码有154个氨基酸的碱性多肽，长链的裂口位于此区。 ;图5.HBV DNA模式图;3.传染源:各种类型的乙肝患者和HBsAg携带者.潜伏期为6周至6个月，平均为3个月. 4.传播途径:由于HBV存在于血液，唾液、泪液、腹水、羊水、尿、精液、阴道分泌物、月经血和乳汁等中，所以传播途径多样且复杂.但主要经血液、母婴和接触传播.;1.高度敏感，可以将HBV的窗口期由60天缩短到49天。从理论上来说，每毫升血清只要有一个病毒就可以检出。 2.基因突变可以导致传统免疫学检测阴性，而基因检测可以避开突变区域，根据其高度保守区设计引物，使其检测结果不受突变影响。例如前核心区域的突变可以引入终止密码子，使;HBeAg的合成提前终止，但新的病毒仍能合成，肝损伤仍在继续。 3.对肝移植的意义 肝脏移植是目前治疗肝硬化晚期的唯一方法，但是85%以上的既往HBV携带者在因肝移植免疫损伤后重新出现，。HBV DNA检测对肝移植的跟踪监测具有重要意义。 4.监测母婴传播 联合应用高效价免疫球蛋白和乙肝疫苗可以有效阻断母婴传播，但仍有些婴儿不敏感，监测婴儿血中的HBV DNA可以对此进行监测，分析阻断失败的原因。 5.检测药物疗效;1.Real time PCR （1）原理 通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。 ;图6.实时定量PCR反应曲线; 由于荧光值突破背景到达阈值所经历的循环数与模板初始拷贝数成正比，可以根据此原理绘制标准曲线。 根据待测样本管荧光值到达阈值经历的循环数，可以确定样品中该基因的初始模板量。 ; 图7.实时定量PCR标准曲线;（2）常用的荧光物质 a.Sybgreen 该染料嵌合到DNA双链中后，经过激发光激发后发出荧光，荧光强度与PCR产物量成正比。;优缺点 优点 a.价格便宜; b.可以做融解曲线分析。 缺点 a.特异性不够好； b.染料对PCR扩增有一定的抑制作用； c.对技术人员的理论水平有较高的要求。;b.Taqman 探针 TaqMan 探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的 5’末端，而淬灭剂则在 3’末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与 3’端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的 5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。 TaqMan 探针适合于各种耐热的聚合酶，如 DyNAzymeTM II DNA 聚合酶（ MJ Research 公司有售）。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。 ;探针序列与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的 5’ 末端，而淬灭剂则在 3’ 末端。;图10. Taqman 探针发光原理 ;优点 a.特异性高于DNA染料法，因为探针序列要与目的序列互 补； b.扩增后的分析对实验人员的理论要求低于DNA染料法。 缺点 a.无法进行融解曲线的分析； b.设计成本较高，价格昂贵。;③分子信标（molecular beacon） ④light upon extention primers(LUX primers) 2.连接酶链反应（LCR） ;四、HBV 基因分型;2.分型方法