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实验三动物性食品生物性污染的检验第1页/共19页 实验三、动物性食品生物性污染 物的检验动物性食品卫生学实验第2页/共19页 一.生物性污染的来源微生物污染 (microorganism pollution )寄生虫污染 (parasitical pollution )昆虫污染 (insectical pollution )第3页/共19页 PathogensSpoilage OrganismsVirusesBacteriumFoodborneInfectionMicroorganismsUnpleasant smell and tasteFungi第4页/共19页 内源性污染外源性污染外源性生物性污染是动物性食品微生物污染的主要途径第5页/共19页 二.生物性污染的评价指标菌落总数细菌总数大肠菌群值（MPN）致病菌检测(PCR法)其他第6页/共19页 实验目的掌握动物性食品菌落总数、大肠菌群测定及常见致病菌PCR检测的原理、步骤和方法了解动物性食品菌落总数的卫生标准，进行卫生判定第7页/共19页 1.鲜乳的微生物学检验菌落总数的测定检 验 处 理24 ±2h或48 ±2h36 ±1 ℃报 告菌落记数每皿加入适量营养琼脂选择3个适宜稀释度，吸取1ml加入灭菌平皿作成几个倍数的稀释液第8页/共19页 注 意 事 项无菌操作稀释度的选择平均菌落数在30-300之间的稀释度为宜；每个稀释度作两个平皿记数要求30-300＞300＜ 30＞300或＜ 30第9页/共19页 2.鲜乳大肠菌群值的测定第10页/共19页 报 告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL(g)检样中大肠菌群的最可能数。判定标准第11页/共19页 3. 常见致病菌的快速检测 ——SE的PCR检测原 理 以扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。不断重复这一过程，可使目的DNA片段得到扩增。因为新合成的DNA也可以作为模板，因而PCR可使DNA的合成量呈指数增长。第12页/共19页 PCR的基本成分模板DNA特异性引物(SEF14)热稳定DNA聚合酶dNTP二价阳离子缓冲液过 程(高温变性、低温退火、中温延伸)第13页/共19页 引物设计 利用引物设计软件Primer5.0针对SEF14主要结构亚单位sefA的基因序列设计引物: 上游引物Usef A为5′-ATGCGTAAATCAGCATCTG-3′；下游引物LsefA为5′-TTAGTTTTGATACTGCTGAAC-3′第14页/共19页 样品处理（模板制备）以12000rpm离心5min,上清液即含基因组DNA待检肉样乳1g/mL以9mL增菌液混合研碎，制成食品匀浆液37℃振荡培养3小时取样液1mL以2000rpm离心2min,取上清液以8000rpm离心5min,沉淀以50uL悬浮沸水浴10min后迅速置冰浴5min第15页/共19页 反应体系10×Buffer 2.5uLdNTP 2.0MgCl2 2.0上游引物（20uM） 1uL下游引物（ 20uM ） 1uL模 板 2uLTaq DNA Polymerase 0.25 灭菌ddH2O up to 25uL第16页/共19页 反应参数1. Initial denature 95 ℃ 5 min 2. Denature 95 ℃ 60s3. Anealing 47 ℃ 60s 4. Elongation 72 ℃ 60sReturn to 2 for 30 cycle5. Final elongation 72 ℃ 10 minKeep 4 ℃ 5 min第17页/