构建点突变质粒步骤.pdfVIP

基因定点突变 一、定点突变的目的 把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。 二、定点突变的原理 通过设计引物，并利用 PCR 将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的 PCR 产物，在 PCR 产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定 就行了。 三、引物设计原则 引物设计的一般原则不再重复。 突变引物设计的特殊原则： （1）通常引物长度为 25~45 bp，我们建议引物长度为 30~35 bp 。一般都是以要突变的 碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为 11-12 bp。若两边引物太短了，很可能 会造成突变实验失败，因为引物至少要 11-12 个 bp 才能与模板搭上，而这种突变 PCR 要求 两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少 12 个 bp，并且合成多一条反向互补的引物。 （2 ）如果设定的引物长度为 30 bp，接下来需要计算引物的 Tm 值，看是否达到 78℃ （GC 含量应大于 40% ）。 （3 ）如果 Tm 值低于 78℃，则适当改变引物的长度以使其 Tm 值达到 78℃（GC 含量 应大于 40% ）。 （4 ）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。 （5 ）最好使用经过纯化的引物。 1 文档来源网络整理 仅供参考 侵权联系删除 Tm 值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5 注：L：引物碱基数；% of GC：引物 GC 含量。 四、引物设计实例 以 GCG→ACG 为例： 5’-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3’ （1）首先设计 30 bp 长的上下游引物，并将 A (T)设计在引物的中央位置。 Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3’ Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3’ 2 文档来源网络整理 仅供参考 侵权联系删除 （2 ）引物 GC 含量为 40% ，L 为 30，将这两个数值带入 Tm 值计算公式，得到其 Tm=75.5 （Tm=0.41×40-675/30+81.5 ）。通过计算可以看出其 Tm 低于 78℃，这样的引物是不合适的， 所以必须调整引物长度。 （3 ）重新调整引物长度。 Primer #1: 5’-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3’ Primer #2: 5’-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3’ 在引物两端加 5mer （斜体下划线处），这样引物的GC 含量为 45.7% ，L 值为 35，将这 两个数值带入 Tm 值计算公式，得到其 Tm 为 80.952 （Tm=0.41×47.5-675/35+81.5 ），这样的 引物就可以用于突变实验了。 五、突变所用聚合酶及 Buffer 引物和质粒都准备好后，当然就是做 PCR 喽，不过对于 PCR 的酶和 buffer，不能用平 时的，我们做 PCR 把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个 K，所以要用那些 GC buffer 或扩 增长片段的 buffer，另外，要用保真性能较好的 PFU 酶来扩增，防止引进新的突变。 除了使用基因定点突变试剂盒，如 Stratagene 和塞百盛的试剂盒，但价格昂贵。可以使 用高保真的聚合酶，如博大泰克的金牌快速 taq 酶、Takara 的 PrimeSTARTMHS DNA polymerase。 六、如何去掉 PCR 产物 最简单的方法就是用 DpnI 酶，DpnI 能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用的模板一 般都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来（除非你用的 是甲基化缺陷型