双水相萃取法.ppt

双水相萃取法; 基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的变化给固-液分离带来了困难，同时这类产品的活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境因素特别敏感。由于它们在有机溶剂中的溶解度低并且会变性，因此传统的溶剂萃取法并不适合。采用在有机相中添加表面活性剂产生反胶束的办法可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。因此基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模生产的、经济简便的、快速高效的分离纯化技术。; 其中双水相萃取技术(two-aqueous phase extraction,ATPS)，又称水溶液两相分配技术(Partion of two aqueous phase extraction)是近年来出现的引人注目、极有前途的新型分离技术。 双水相萃取法的特点是能够保留产物的活性，整个操作可以连续化，在除去细胞或细胞碎片时，还可以纯化蛋白质2～5倍，与传统的过滤法和离心法去除细胞碎片相比，无论在收率上还是成本上都要优越得多。;双水相萃取法和传统的分离方法(如盐析或有机溶剂沉淀等)相比也有很大的优势，如以β-半乳糖苷酶为例，用沉淀或双水相萃取纯化的比较见下表。除此以外，处理量相同时，双水相萃取法比传统的分离方法,设备需用量要少3～10倍，因此已被广泛地应用在生物化学、细胞生物学和生物化工领域，进行生物转化、蛋白质、核酸和病毒等产品的分离纯化和分析等。用此法来提纯的酶已达数十种，其分离过程也达到相当规模，如乙醇脱氢酶的分离已达到几十千克湿细胞规模，β-半乳糖苷酶的提取也到了中试规模等。; 聚合物的不相溶性(incompatibility)：当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对分子质量较大，分子间的相互排斥作用与混合过程的熵增加相比占主导地位，一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合物的不相容性。 可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)/葡聚糖(dextran，Dx)，聚丙二醇(polypropylene glycol) / 聚乙二醇和甲基纤维素(methylcellulose)/葡聚糖等。???水相萃取中常采用的双聚合物系统为PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。除双聚合物系统外，聚合物与无机盐的混合溶液也可形成双水相，例如，PEG/磷酸钾(KPi)、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于生物产物的双水相萃取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG，下相富含无机盐。;均相区; 在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而体积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即;第八页，共五十六页，2022年，8月28日;2 .双水相中的分配平衡;已有的大量研究表明，生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统间的各种相互作用，其中主要有静电作用、疏水作用和生物亲和作用等。因此，分配系数是各种相互作用的和:;1．静电作用;第十二页，共五十六页，2022年，8月28日;实际的双水相系统中通常含有缓冲液和无机盐等电解质，当这些离子在两相中分配浓度不同时(即分配系数≠1)，将在两相间产生电位差，此时，荷电溶质的分配平衡将受相间电位的影响，从相平衡热力学理论推导溶质的分配系数表达式为;2．疏水作用;lnmaa=HF(RH+B);利用前式可确定不同双水相系统的HF值。如果在pH为等电点的双水相中蛋白质的分配系数(m0)与HF值之间呈线性关系，则直线的斜率定义为该蛋白质的表面疏水性，用HFS (hydrophobic factor of solutes)表示;3. 影响物质分配平衡的因素;3.1 双水相中聚合物组成的影响;;系线长度代表了系统达到平衡时上、下相和总组成的关系，在临界点附近系线的长度趋向于零，上相和下相的组成相同，因此,分配系数应该是1。随着聚合物和成相盐浓度增大，;3.3 盐和缓冲液的影响;3.4 温度的影响; 大规模双水相萃取操作一般在室温下进行，不需冷却。这是基于以下原因： (1)成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用，常温下蛋白质一般不会发生失活或变性； (2)常温下溶液粘度较低，容易相分离； (3)常温操作节省冷却费用。 ;在生物分子回收和纯化以后，怎样从含有目标产物残余物的水溶液中回收聚合物或盐就成为一个重要的问题。例如从1000kg面包酵母中萃取反丁烯二酸酶需要用680kgPEG-1550和533kgK3PO4，若不回收利用，化学品的消耗会使生产成本大幅度上升。如果产品是蛋白质，并且分配在盐相，则盐可以在错流过程操作方法下，用超滤或渗析膜过滤回收。如果蛋白质积