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噬菌体载体的课件资料;第2页/共56页;噬菌体定义： 是一类细菌病毒的总称。 噬菌体与质粒的区别 * 质粒：仅是一种含有复制起点的裸露的DNA分子。 * 噬菌体：DNA分子除了复制起点之外，还有编码外壳蛋白质的基因。;噬菌体或病毒DNA;第一节 噬菌体的一般生物学特性;(241页);;1. 噬菌体的结构及其核酸类型： 噬菌体的核酸： 最常见的是：双链线性DNA。 还有双链环形DNA、 单链环形DNA、 单链线形DNA、 单链RNA。 有些噬菌体DNA碱基不是由标准的A、T、C、G四种碱基组成。 如T4噬菌体DNA中没有C，取代的是5-羟甲基胞嘧啶（HMC）。;1. 噬菌体的结构及其核酸类型： 常用作基因工程的噬菌体： ◆双链噬菌体：λ噬菌体。 * 野生型λ噬菌体经过改造，已衍生出100多种克隆载体。 *目前常用的有： EMBL系列、 λgt系列、 Charon系列。 ◆单链噬菌体：M13噬菌体。;2. 噬菌体的感染性;2. 噬菌体的感染性;2. 噬菌体的感染性;234页;3. 噬菌体的溶菌生命周期;3. 噬菌体的溶菌生命周期;(242页);4. 噬菌体的溶源生命周期;234页;4. 噬菌体的溶源生命周期;(244页);4. 噬菌体的溶源生命周期;4. 噬菌体的溶源生命周期;5. 重组噬菌体的分离;5. 重组噬菌体的分离;(248页);第二节 λ噬菌体载体;λ噬菌体：;1. λ噬菌体的分子生物学概述;(250页);λ噬菌体基因组的三个区域;(250页);（2）λ噬菌体DNA的复制 在λ噬菌体感染的早期，环形的λDNA分子按θ形式从双向进行复制。 到了晚期，控制滚环复制机理的开关被启动了，合成出由一系列线性排列的λ基因组DNA组成的长多连体分子。 多连体分子经过核酸酶的切割作用，从cos位点将它分离成单体分子之后，才能够包装。;在电子显微镜下观察正在复制的DNA， 复制的区域如一只眼睛（张玉静，101）;（张玉静，141）;（张玉静，141）;2. λ噬菌体载体的构建及其主要类型;插入型载体：只能承受较小分子量(一般在10kb以内)的外源DNA片段的插入，广泛用于cDNA及小片段DNA的克隆。 替换型载体：可承受较大分子量的外源DNA片段的插入，适用于克隆高等真核生物的染色体。;（2）λ噬菌体载体的主要类型 Ⅰ、插入型载体： 插入失活效应：外源的DNA 克隆到插入型的λ噬菌体载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力。 免疫功能失活的插入型载体：在基因组的免疫区中插入外源DNA片段，载体所具有的合成活性阻遏物的功能遭受破坏，而不能进入溶源周期。只能形成清晰的噬菌斑。 * 有外源DNA插入：清晰的噬菌斑。 * 没有外源DNA插入：亲本噬菌体可以进入溶源状态，形成浑浊的噬菌斑。 β-半乳糖苷酶失活的插入型载体：（下页）;β-半乳糖苷酶失活的插入型载体：;具有功能活性的β-半乳糖苷酶是四聚体。 Xgal（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside) ：无色化合物。β-半乳糖苷酶能将无色的Xgal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-氯靛蓝。因此，Xgal可作为检测β-半乳糖苷酶的一种指示剂。 IPTG：一种含硫的乳糖类似物。在不存在底物乳糖的条件下，它可以诱导细胞合成β-半乳糖苷酶。 称IPTG为β-半乳糖苷酶的安慰诱导物。 乳糖诱导物IPTG（372页）;(257页);Ⅱ、替换型载体;(257页);Ⅱ、替换型载体;用替换型载体克隆外源DNA片段包括三个步骤;（3）凯伦噬菌体载体;(253页);3. λ噬菌体的改良;λ噬菌体的体外包装（1） λ重组体DNA分子的转染作用;（2）λDNA的体外包装;(267页);（2）λDNA的体外包装;(268页);（2）λDNA的体外包装;（3）λ噬菌体的包装限制问题;谢谢观看！