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保持其免疫活性的测定方法酶联免疫吸附测定法 01检测简介注意事项基本原理检测步骤目录030204 05检测方法酶标记法标记用酶效果测定目录070608 基本信息1971年瑞典学者Engvall和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)。ELISA已成为分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术( immunoenzymatic techniques )的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。 检测简介 检测简介酶联免疫实验洗板酶联免疫吸附剂测定法，简称酶联免疫法，或者ELISA法。它的中心就是让抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。 基本原理 基本原理①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体②酶标记的抗原或抗体③酶作用的底物（显色剂）。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 注意事项 注意事项⒈　正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。⒉　在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括：⑴　固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。当前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。⑵　包被抗体（或抗原）的选择：将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度要好，吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响，一般多采用4℃、18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0.1、1.0和10μg/ml等）进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD（optical density-光密度）值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg/ml。⑶　酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定（见酶标记抗体部份）。然后再固定其它条件或采取“方阵法”（包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度）在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。 检测步骤 检测步骤ELISA用血清来检测，首先血液要经过至少半个小时的凝集，然后取血清。将酶复合物用稀释液稀释后，加血清及阴性、阳性对照，还有就是质控品（这是严格的要求，它的范围必须在质控范围内）。经过一个小时的孵育，然后洗板，加底物，半个小时避光反应后加终止液即完成反应部分，然后就是读数。由数值来判断结果的阴性或阳性。 检测方法 检测方法双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：一、将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。二、加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。三、加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。四、加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。根据同样原理，将大分子抗体分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如