纳米级生物分子测量的新方法和新技术.pptx

纳米级生物分子测量的新方法和新技术 肖忠党 国家教育部分子与生物分子电子学重点实验室东南大学，吴健雄实验室东南大学，生物科学与医学工程系 杭州 2003.9.13 主 要 内 容? 生物分子测量的常规手段? 生物分子测量技术的发展? 生物单分子测量的新技术? 存在的问题及展望 X射线衍射中子衍射法分子晶体核磁共振法园二色谱法荧光光谱法喇曼光谱法小角散射溶液状态生物分子生物分子空间结构测量? 生物分子测量的常规手段 生物分子空间结构测量各种显微镜技术荧光显微镜激光共聚焦显微镜电子显微镜扫描探针显微镜近场光学显微镜 生物分子动力学测量核磁共振法园二色谱法荧光光谱法喇曼光谱法小角散射快速混合停流谱（Mixing Stopped-flow Spectroscopy）时间分辨波谱等等慢反应过程（分钟级）快反应过程（毫秒级）（如蛋白质折叠） 常规生物分子测量技术的局限性有限的时间分辨率分子测量结果为很多分子的平均有限的空间分辨? 生物分子测量技术的发展 1、第三代同步辐射波谱技术光束线出口在CCD探测器上成像的单色光斑 蛋白晶体衍射图样 同步辐射光具有高亮度、高度单色、高度准直，高稳定性，以及宽波谱等优点，同步辐射波谱具有更高的灵敏度和良好的空间分辨率 中科大国家同步辐射实验室第二代同步辐射北京高能所同步辐射装置 第一代同步辐射 2、超快混合连续流动谱技术Comparison of experimental methods for detection of fast protein folding reactions and their accessible time-scalesBieri O., Kiefhaber T., Biol. Chem. 380(1999)923 温度跃变只适用于肽类和极少数在合适温区发生冷变形的蛋白质分子光化学触发需要给蛋白质分子结合上特殊的光敏基团NMR迟豫以及压力跃变方法只适合分子折叠的转变态为什么选择超快混合连续流谱技术？1）超快混合技术是一种通用的手段2）应用超快混合连续流谱技术可以在非常接近蛋白质分子 天然状态的情形下研究其折叠过程 Bieri O., Kiefhaber T., Biol.Chem. 380(1999)923 连续流动超快混合反应光谱仪结果图 Figure 3 Dead time calibration of the mixer. (a) Plot of the fluorescence quenching reaction of NATA by NBS at different final NBS concentration. [NATA]final=20 ?m. (b) The solid line is a fit to the plot of the pseudo-first-order rate constants as a function of NBS concentration. This yields the second-order rate constants for the NATA-NBS reaction of 6.8X10-5 M-1S-1. 超快混合连续流谱技术研究免疫球蛋白Im7的折叠中间体Im7是由53个氨基酸组成的免疫球蛋白分子，具有四个?螺旋结构。已经证明其折叠只有一个中间态，但是其折叠途径可能有两个模型 。 Figure 4. Fluorescence changes during the folding of Im7. Data on the microsecond time-scale were acquired using a novel microcapillary continuous-flow rapid mixing device equipped with a UV sensitive CCD camera (built by Shastry and Roder). These data were then normalised and combined with stopped-flow data on a millisecond timescale to cover the entire time-course of Im7 folding. The combined data at a wide range of urea concentrations (two representative concentrations are shown as labelled) were then fitted simultaneously to a variety of three-state kinetic