目的基因片断的体外扩增讲解.pptVIP

35 35 35 实验二、 目的基因片断的体外扩增 讲解 （2） 一、PCR 的概念 二、PCR 的基本原理 三、PCR 的基本流程 四、PCR反应体系的各成分及其对PCR的影响 讲解内容 (2) 五、PCR反应条件的确定 六、常见问题与对策 变性 退火 延伸 循环次数 主要包括： Half life of Taq DNA polymerase 一般选用94～95 ℃。 92.5 ℃ 2 hours， 95 ℃ 40 mins， 97 ℃ 5 mins. 30 个循环时， 变性温度： 变性时间： 变性共需要 15 ~ 22.5 min。 五、PCR反应条件的确定 一般选用30～45 秒。 变性 退火 延伸 循环次数 主要包括： 五、PCR反应条件的确定 退火是影响 PCR 特异性的重要因素！ (1) Correct annealing temperature Priming occures only at the desired target sites. (1) 退火温度 对 PCR 反应的影响： (3) (2) (2) Annealing temperature is too high Primers and templates tends to be dissociated. Priming occures only at the desired target sites. (1) 退火温度偏高，产物量减少，但反应特异性 (specificity)高。 (3) (2) (1) Correct annealing temperature 退火温度 对 PCR 反应的影响： (2) Annealing temperature is too high Primers and templates tends to be dissociated. Mismatched hybrid. Priming occures only at the desired target sites. (1) 退火温度偏高，产物量减少，但反应特异性 (specificity)高。 (3) (2) (2) Annealing temperature is too low (1) Correct annealing temperature 退火温度 对 PCR 反应的影响： 五、PCR反应条件的确定 变性 退火 延伸 循环数 主要包括： 长度 20 mer 的引物， Tm 计算公式为：＝4℃(G + C)+ 2℃(A + T) 退火温度 = Tm －（2～10℃） 退火温度：50℃~65℃。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55 ℃作为退火温度的起点较为理想。 较高的退火温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。 但退火温度不能太高，要保证引物同目的序列有效退火。 通过参考引物的 Tm 值，选择退火温度 Tm (melting temperature, 解链温度) : 当 50％ 的引物与互补序列表现为双链DNA分子时的温度。 五、PCR反应条件的确定 变性 退火 延伸 循环次数 主要包括： Taq 酶的最适工作温度：72℃或74℃ 温度： 取决于待扩增基因片段的长短 酶的延伸效率： 约 1kb/min。 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 3～4kb的靶序列需3～4min 延伸时间过长会导致非特异性扩增 时间： 五、PCR反应条件的确定 变性 退火 延伸 循环次数 主要包括： 一般地， 30 cycles 循环次数过多会增加碱基的错配几率，非特异性产物的量亦增多。 94℃ 45S，55℃ 1min，72℃ 2min。 30 个循环 。 72℃ 延伸10min。 典型的PCR条件： 热启动 : 94℃（或95℃）, 3～10min 决定了 PCR 扩增程度 六、常见问题与对策 无扩增产物 假阳性 非特异性扩增 拖尾 主要包括： 1) 模板: ① 提取的模板中含有杂质。如：蛋白质、氯仿、 乙醇、EDTA等抑制了Taq 酶活性 ② 模板的浓度可能不合适。 2) 引物： ① 引物设计不合理：如，特异性长度不够，引物二聚体等。 ② 引物降解。引物应高浓度小量分装冻存，防止多次冻融导致引物发生降解。 3) DNA聚