蛋白致敏性细胞学评价技术规范征求意见稿.docx

GB/T XXXXX – 2012 GB/T XXXXX – 2012 PAGE PAGE 3 PAGE 1 GB/T XXXXX—2012 GB/T XXXXX—2012 PAGE PAGE II 发布GB/T XXXXX—201X 中华人民共和国国家标准 发布 GB/T XXXXX—201X 中华人民共和国国家标准 ICS 07 ICS 07.080 A 21 蛋白质致敏性细胞学评价技术规范 蛋白质致敏性细胞学评价技术规范 Technical specifications of protein allergenicity in vitrobased on cellular assay （征求意见稿） 发布中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会201X-XX-XX 发布 发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会 201X-XX-XX 发布 201X-XX-XX实施 GB/T××××—201× 蛋白质致敏性细胞学评价技术规范 1 范围 本标准规定了以嗜碱性粒细胞活化试验对蛋白质致敏性评价的方法，包括仪器和设备，试剂和材料，分析步骤及结果计算。 本标准适用于蛋白质的细胞致敏性测定，包括β-氨基己糖苷酶释放率、半最大效应浓度。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 3 术语与定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 β-氨基己糖苷酶释放率β-hexosaminidase release rate 蛋白质与处于活化状态的RBL-2H3细胞结合后，会使其产生脱颗粒效应从而导致β－氨基己糖苷酶的释放，上清液中β－氨基己糖苷酶含量与细胞内总的β－氨基己糖苷酶含量的比值表示β-氨基己糖苷酶释放率。 3.2 半最大效应浓度concentration for 50% of maximal effect,EC50 指β-氨基己糖苷酶最大释放率的一半时对应的蛋白质浓度。 4 原理 嗜碱性粒细胞RBL-2H3细胞表面含有大量高亲和力IgE受体，当处于被IgE活化状态时，RBL-2H3细胞与蛋白质结合后，会引起细胞膜稳定性下降，产生脱颗粒效应，从而在胞外释放出β－氨基己糖苷酶等生物活性物质，通过测定β－氨基己糖苷酶释放率和半最大效应浓度可以评价蛋白质致敏程度。 5 仪器和设备 5.1 离心机：相对离心力≥1000×g 5.2 微量移液器：规格2.5μL，20μL，200 μL，1 mL 5.3 恒温水浴锅：精度0.1℃ 5.4 二氧化碳细胞培养箱：精度0.1℃ 5.5 电子分析天平：精度0.1mg 5.6 酶标仪: 检测波长405 nm 6 试剂和材料 使用分析纯试剂和符合GB/T 6682 规定的二级水，除非另有说明。 6.1 小鼠IgE抗体 6.2 10 mmol/L磷酸盐缓冲液，pH7.2（，） 称取80 g NaCl，2 g KCl，2 g KH2PO4，36.2 g Na2HPO4·12H2O，溶于超纯水，全部溶解后，定容至1000 mL，充分混匀后，调pH至7.2，0.22μm微孔滤膜滤过除菌，4 ℃保存备用或购买同类商品化产品。 6.3 嗜碱性粒细胞系：RBL-2H3 (ATCC CRL-2256) 6.4 MEM细胞培养基 取5%终体积的水加入到1L烧杯中，将MEM干粉培养基倒入烧杯，水洗包装袋内面两次，倒入烧杯中，磁力搅拌助溶，随后加入2.2 g NaHCO3，2.383gHEPES。加水定容至1000mL，用HCl或者NaOH调节pH至7.2，0.22μm微孔滤膜滤过除菌，4 ℃保存备用或购买同类商品化产品。临用前加10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素/链霉素。 6.5 PNAG溶液 称取3.68 g Na2HPO4·12H2O，0.933 g柠檬酸，溶解后加入34.2 g 4-nitrophenylNacetyl-p-D-glucosaminide（PNAG），加超纯水定容至100 mL，即为1 mmol/L PNAG溶液。 6.6 Na2CO3终止液 称取5g Na2CO3，加水定容至118 mL，避光保存。 6.7 台氏液（Tyrode’s） 准确称取8.0gNaCl, 0.2gKCl, 0.26g MgSO4.7H2O, 0.065g NaH2PO4.2H2O, 1.0g NaHCO3, 0.2g CaCl2和1.0g葡萄糖，加水定容至1000 mL，充分混匀后，调pH至7.2，0.2μm微孔滤膜滤过除菌，4 ℃保存备用或购买同类商品化产品。