基因表达分析技术.pptxVIP

基因表达分析技术;;一、通过检测mRNA 揭示基因转录水平的表达特征;（一）基于杂交原理检测mRNA的表达水平;三种印迹技术的比较;RNA琼脂糖凝胶电泳;;放射自显影照片;2．核糖核酸酶保护实验 （ribonuclease protection assay，RPA） 是灵敏度和特异性很高的mRNA定量分析方法 基本原理 是将标记的特异RNA探针（32P或生物素）与待测的RNA样品液相杂交，标记的特异RNA探针与目的RNA结合，形成双链RNA，免受RNA酶的消化；而未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸。 ;RPA基本程序：;核糖核酸酶保护实验原理示意图;RPA比Northern Blot的优势：;可细胞或组织中原位表达的mRNA进行区域定位 标记探针特异性地与目标靶mRNA序列杂交，检测标记信号来确定基因在组织和细胞内表达的区位信息。 可作为定量分析的补充。 ;原位杂交技术主要步骤：;（二）RT-PCR常用的mRNA检测方法;;PCR技术原理;;;模板DNA 特??性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ ;PCR的基本反应步骤;实验仪器;琼脂糖凝胶电泳槽;PCR仪;;实验结果;凝胶成像系统;Target Amplification;常规PCR方法的局限性分析：;2、实时荧光定量PCR （real-time PCR）;非特异性的嵌入荧光染料 （Non-specific DNA binding dyes）;;实时PCR技术原理;非特异性的嵌入荧光染料评价;TaqMan探针 评价;Ct value and Real-Time Quantitative PCR Theory; 模板起始浓度越高，Ct值越小 Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系;;;;原位ＰＣＲ;;;操作步骤 1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶） 2. PCR扩增细胞内目的片段 3. 原位杂交检测扩增产物;DNA芯片(DNA chip) cDNA芯片(cDNA chip) 是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上 。;;二、通过蛋白质检测揭示基因 翻译水平的表达特征; 蛋白质样品的制备 SDS分离 蛋白质转膜 特异抗体（即第一抗体）与膜上的蛋白质（抗原）印迹杂交 再经偶联了可检测标记信号的第二抗体（即抗抗体，商品试剂盒中多采用偶联辣根过氧化物酶的Ig） 最后经与酶的底物反应而显影、成像，经扫描后获取免疫印迹信息;第49页/共82页;第50页/共82页;第51页/共82页;West Blot ;受检标本+固相载体表面的抗原或抗体起反应——结合特异抗体（一抗）酶连接的第二抗体（也可预先包被抗体，“吸附”抗原），再进行酶-底物反应。反应后通过专门的酶标仪测定、记录数据。 ;特点： 1、具有特异性； 2、灵敏度很高； 3、稳定、操作简便，标本用量少，适于大规模筛查， 尤 其适用于检测体液中微量的特异性抗体或抗原； 4、既可以做定性试验也可以做定量分析。 ; 免疫组织化学（immunohistochemistry）是利用标记的特异性抗体通过抗原-抗体反应和显色反应，在组织或细胞原位检测特定抗原（即目标蛋白质）的方法，简称为免疫组化实验。近年来由于荧光标记抗体的广泛应用，这两种方法又被统称为免疫荧光法。 ;;人皮肤角化细胞免疫荧光染色;（immunofluorescence），可应用荧光（倒置）显微镜或激光共聚焦显微镜（confocal microscopy）对靶分子进行定性、定量和定位分析，激光共聚焦显微镜还可进行断层成像，是在蛋白质水平分析基因表达的直观方法。 其中抗体对于蛋白质靶点的特异性、种间交叉反应、检测系统的灵敏性以及细胞或组织的固定类型是该方法的关键因素。 运用双重着色或多重着色程序同时对多个感兴趣的靶分子进行检测，是一种揭示更多有关细胞群的功能和它们之间相互作用信息的有效方法。 免疫组化主要是作为定性、定位的技术，若结合密度计量系统、图像分析系统等测量工具也可以得到定量的数据。 ; 流式细胞术（flow cytometry）在细胞水平分析特定蛋白质的基本原理也是抗原-抗体反应，它利用荧光标记抗体与抗原的特异性结合，经过流式细胞仪分析荧光信号，从而根据细胞表达特定蛋白质的水平对某种蛋白质阳性细胞（即特异基因表达的细胞）作出判断。 ;流式细胞术可以检测活细胞，也可以检测用甲醛固定的细胞。 广泛应用于细胞表面和细胞内分子表达水平的定量分析，并能够根据各种蛋白质的表达模式区分细胞亚群。 此外，流式细胞术可以使用多个荧光标记的抗体同