3种分子检测方法对肺结核的诊断价值比较.docx

? ? 3种分子检测方法对肺结核的诊断价值比较* ? ? 彭利君，刘立宾，王静，方婷婷，蔡龙(浙江大学医学院附属杭州市胸科医院临床医学检验实验中心，杭州 310003) 结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起的结核病 (tuberculosis，TB)仍然是威胁全球人类健康的主要传染病之一[1]。肺部是临床最常见的TB发病部位，早期诊断对于传染控制、减缓疾病进展及改善患者预后至关重要。痰涂片镜检经济、易于操作，但其敏感性较低，且不能区分MTB和非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)感染。分枝杆菌培养敏感性较高，一直作为TB的金标准，但其检测周期长，不利于肺结核的快速诊断。随着分子诊断技术的进步，核酸扩增试验极大地促进了TB的诊断。痰是常用于诊断肺结核的样本。然而，一些活动性肺结核患者可能无法咳出痰，这被称为无痰或少痰的肺结核。研究表明，支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)较痰标本改善了肺结核的诊断[2-4]。 博奥结核/非结核分枝杆菌核酸检测(DNA-TB)、结核分枝杆菌RNA恒温扩增实时检测技术(simultaneous amplification and testing forMycobacteriumtuberculosis，SAT-TB)和Xpert MTB/RIF检测(Xpert)这3种分子检测方法在临床TB诊断中广泛运用，但这些方法在BALF样本中的诊断价值尚未得到全面评估。因此，本研究以分枝杆菌培养为金标准，旨在通过大样本量数据分析，评价DNA-TB、SAT-TB和Xpert 3种分子检测方法对BALF样本TB的诊断价值，为临床医生选择检测方法时提供依据。 1 材料和方法 1.1研究对象 收集2016年7月至2021年9月在浙江大学医学院附属杭州市胸科医院就诊并使用同一份BALF样本进行涂片、培养、DNA-TB、SAT-TB和Xpert 5项检测的9 617名门诊和住院患者的医疗记录，排除688名诊断不明确的患者，最终共纳入8 929名患者，其中5 357名(占60.0%)男性，3 572名(占40.0%)女性，年龄(59.9±19.6)岁。本研究经浙江大学医学院附属杭州市胸科医院人体研究伦理委员会批准[批准文件号：2021快审(42)号]，免除患者知情同意。 1.2仪器及试剂 抗酸染色试剂(珠海贝索公司)；Bactec MGIT 960液体培养仪及培养和药敏配套试剂(美国BD公司)；Xpert实时荧光PCR检测仪及配套试剂(美国Cepheid公司)；实时荧光定量检测仪(SLAN-96S，上海宏石公司)；结核分枝杆菌核酸检测试剂盒(RNA恒温扩增法，上海仁度公司)；结核/非结核分枝杆菌核酸检测试剂盒(PCR荧光探针法，博奥公司)；Lowenstein-Jensen固体培养基(杭州创新公司)；固体药敏及配套试剂(珠海贝索公司)。 1.3方法 1.3.1标本采集和处理 通过纤维支气管镜进行异常肺段灌洗以获得BALF标本，将标本分成五等份，每份1～3 mL，分别用于涂片、培养、DNA-TB、SAT-TB和Xpert检测。 1.3.2涂片 采用抗酸染色试剂对每份BALF样本行3张Ziehl-Neelsen抗酸染色镜检，其中1张涂片镜检阳性则为涂片阳性。MTB和NTM由于其菌体特性，涂片显示为抗酸染色阳性。 1.3.3培养及利福平的表型药敏检测 按试剂说明书操作，使用Lowenstein-Jensen固体培养基或液体培养基对BALF样本进行分枝杆菌培养和利福平药敏试验。固体培养在37 ℃温箱进行，液体培养使用BACTEC MGIT 960分枝杆菌培养仪。固体培养65 d未长出肉眼可见的菌落判为阴性，液体培养42 d仪器检测信号未达到阳性标准且人工复核阴性则判为阴性。阳性培养菌株经DNA-TB检测鉴定为MTB培养阳性，若鉴定为NTM则视为MTB培养阴性。固体或液体培养均阴性视为MTB培养阴性。利福平的表型药敏检测是将从BALF分离得到的MTB菌株在已知利福平浓度的固体或液体培养基中进行体外培养，观察其生长状况，同时与不加任何药物的对照管比较，若菌株在对照及药物培养管中均生长，为利福平耐药；若只在对照管中生长，则认为该菌株对利福平敏感。 1.3.4Xpert MTB/RIF 按试剂说明书操作，在1～2 mL未离心BALF中加入2倍体积的处理液，涡旋振荡15～30 s并室温放置15 min，取2 mL处理过的样本缓慢添加到Xpert实时荧光PCR检测仪反应盒中，然后将反应盒置于检测模块。2 h后系统可自动读出MTB检测结果与利福平耐药情况。实验结果显示MTB检出极低、检出低、检出中等和