实验酶切和连接.ppt

第一页，共二十四页，2022年，8月28日 DNA克隆（重组）技术的基本程序包括： （1）获得外源DNA：外源DNA是进行DNA重组的目的DNA片段，一般采用DNA聚合酶链式反应(PCR)或逆转录-DNA聚合酶链式反应(RT-PCR)、基因组文库或cDNA文库筛选等方法获得。 （2）载体的构建或选择：分子生物学中用的载体是指能在特定宿主细胞中自主复制的DNA分子，例如细菌的质粒、噬菌体、病毒等，常用的载体一般为质粒；根据需要可直接从公司购买合适的载体，也可以自己构建。 第二页，共二十四页，2022年，8月28日 （3）连接：目的DNA片段和适当载体的连接,一般采用核酸内切酶分别消化DNA片段和载体，使它们的末端能够连接到一起构成重组DNA分子。由于所用内切酶的切割特点不同，产生三种连接方式：粘端连接、平端连接和不相配的连接。 （4）转化：将连接的重组DNA产物导入合适的宿主细胞，使其在宿主细胞内复制扩增或表达，赋予宿主细胞新的生物特征。 （5）克隆化：重组DNA分子转化大肠杆菌后，在平板培养基上筛选出单个菌落，此菌落经过酶切鉴定或杂交实验后确定为含重组DNA分子的单克隆。 第三页，共二十四页，2022年，8月28日 DNA克隆 　　DNA克隆的技术路线大致包括以下几个程序：① 分离制备待克隆的DNA片段(目的DNA)。② 选择合适的载体 。③在体外连接目的DNA和载体。④将重组DNA分子转入宿主细胞，并筛选和鉴定阳性重组子。⑤ 扩增阳性重组子。 第四页，共二十四页，2022年，8月28日 实验九 质粒酶切与鉴定 第五页，共二十四页，2022年，8月28日 一. 实验目的 了解质粒酶切鉴定原理。 掌握核酸片断回收纯化操作技术 3. 学习核酸片断连接的原理和方法 第六页，共二十四页，2022年，8月28日 二. 实验原理 (质粒酶切与鉴定 ) 使用限制性内切酶获得粘性末端的目的基因 核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统， 用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭 限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键， 产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。 第七页，共二十四页，2022年，8月28日 限制性内切酶是一种工具酶，这类酶的特点是具有能够识别双链DNA 分子上的特异核苷酸顺序的能力，能在这个特异性核苷酸序列内，切断DNA 的双链，形成一定长度和顺序DNA 片段。如：Not I的识别序列和切口是：  限制性内切酶切口 酶切片段 电泳凝胶的区带数, 酶切片段大小 第八页，共二十四页，2022年，8月28日 三. 仪器和试剂 1．主要仪器 （1） 1.5mL塑料离心管（2）微量加样器10μL、100μL、1 000μL 各一支（3）台式高速离心机（20 000r/min）（4）水浴锅 （5）电泳仪，电泳槽2．材料 大肠杆菌DH5α质粒 第九页，共二十四页，2022年，8月28日 3．试剂 （1）限制性内切酶Not I及相应的缓冲液；（2）电泳试剂 1xTBE 缓冲液 EB 染色液(0.5μg/mL)。 第十页，共二十四页，2022年，8月28日 四. 操作步骤 1. 反应体系的建立： ⑴ 在一无菌1.5 ml Eppendorf管中加入： 　　 无菌双蒸水 10.5 μl　　 10×酶切缓冲液 2 μl　　 质粒DNA(100 ng/μl) 7 μl　　 NotⅠ(10U/μl) 0.5 μl 　　 总体积为20μl 　⑵ 轻轻混匀，12000 rpm离心5 sec。 第十一页，共二十四页，2022年，8月28日 操作注意事项： 　　1. 吸样量一定要准确　　2. 加样按体积从大到小，最后加酶　　3. 要求在冰上操作，并充分混匀，　　4. 开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。　　5. 样品在37 ℃与65 ℃保温时，将离心管盖严，以防水进入管内造成实验失败。 2. 37 ℃水浴1 h。 3. 将Eppendorf管置65 ℃水浴中10 min，通过加热使酶失活以终止反应。 第十二页，共二十四页，2022年，8月28日 4．DNA 琼脂糖凝胶电泳检测 （1）水平放置胶槽，放入合适的梳子。 （2）1%琼脂糖凝胶的制备：称取0.3g 琼脂