ECT6和ECT7调控拟南芥开花时间的研究.docx

? ? ECT6和ECT7调控拟南芥开花时间的研究 ? ? 刘丹阳，徐遵涛,2，丁 勇* (1 中国科学技术大学 生命科学学院，合肥 230027;2 安徽省农业科学院，合肥 230031) 开花是植物从营养生长向生殖生长转变的标志，适当的开花时间是高等植物有性繁殖成功的基础[1-2]。植物的开花时间受到内部环境和外界环境共同调控，主要的调控途径可分为光周期途径、春化途径、自主途径、赤霉素途径和温度途径，这些途径协同作用，精确调控拟南芥的成花转变过程[3-5]。 作为开花通路中关键的开花抑制基因，FLOWERINGLOCUSC(FLC) 编码一类MADS box转录因子，通过直接抑制2个开花通路整合因子FLOWERINGLOCUST(FT) 和SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS1 (SOC1) 的转录来抑制开花[6-8]。FLC受到春化途径和自主途径的调控。在春化过程中，VERNALIZATION 5 (VRN5)、VERNALIZATION INSENSITIVE 3 (VIN3) 和VERNALIZATION 2 (VRN2) 等形成的PHD-PRC2复合体，对FLC位点表观沉默，抑制FLC表达从而促进开花[8]。而在自主途径中，FCA、FY、FPA、Flowering locus VE (FVE)、FLOWERING LOCUS K (FLK) 和FLOWERING LOCUS D (FLD) 通过RNA的代谢和染色质状态的调控，抑制FLC转录[9]。 N6-甲基腺嘌呤 (N6-methyladenosine, m6A) 就是腺苷酸第6位氮原子上的氢原子被甲基所替换，这一修饰在RNA修饰中的比例高至80%，在mRNA中的比例达到50%[10]。m6A修饰由甲基转移酶、去甲基化酶和m6A“阅读器”共同参与。m6A“阅读器”识别并结合m6A修饰的RNA，影响其行使生物学功能。 哺乳动物中YTHDF (YTH domain family) 家族蛋白是一类YTH (YT521-B homology) 结构域蛋白，包括YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3，它们能够识别并结合m6A修饰的RNA，具有不同的生物学功能。相关研究表明，YTHDF1促进mRNA的翻译，YTHDF2促进mRNA的降解，而YTHDF3同时促进翻译和降解[11-14]。拟南芥中的ECT蛋白家族是YTHDF家族的同源蛋白。现有研究表明，ECT可参与拟南芥生长发育和胁迫响应的调控。ECT2可调控拟南芥的毛状体分枝数量，这一调控作用依赖于其m6A结合能力[15-16]。此外，ECT2、ECT3和ECT4共同作用，控制叶片形成时间和叶片形态发育[17]。热处理后ECT2进入应激颗粒中，这表明ECT可能参与胁迫响应[15]。然而，拟南芥ECT家族基因能否参与调控开花时间，尚未见报道。 本研究通过qRT-PCR的方法，对开花相关基因ECT6和ECT7参与拟南芥开花时间的调控进行分析，初步探讨了ECT6和ECT7调控开花时间的分子机理，为研究ECT家族和m6A在开花调控中的功能提供参考。 1 材料和方法 1.1 植物材料 本研究材料为野生型拟南芥哥伦比亚生态型 (Col-0)，T-DNA插入突变体ect6-1 (SAIL_76_D06)、ect6-2 (SALK_083381)、ect7-1 (SALK_203118)和ect7-2 (SALK_105881) 购自美国ABRC (Arabidopsis Biological Resource Center) 种子库。研究中用到的双突变体材料ect6-1ect7-1和ect6-2ect7-2通过突变体杂交获得。 1.2 实验方法 1.2.1 基因组提取与基因型鉴定(1)基因组提取：取生长20 d左右的野生型和突变体幼苗，利用CTAB法提取其基因组。加入CTAB溶液并高速破碎，通过氯仿萃取、异丙醇沉淀、75%乙醇沉淀以提取得到拟南芥基因组。 (2)基因型鉴定：分别在目的基因的基因组上T-DNA插入位点两侧(LP和RP)和T-DNA插入区段上 (BP) 设计引物，通过三引物法进行PCR鉴定(表1)。T-DNA的长度较长，大于10 kb，PCR无法跨T-DNA扩增出条带。因此，野生型的两条染色体上均没有T-DNA插入，可扩增出以LP+RP为引物的条带(一条带，约900 bp)；纯合突变体的两条染色体上均有T-DNA插入，可扩增出以BP+RP为引物的条带(一条带，约400～700 bp)；杂合子：等位基因的一条染色体上有T-DNA插入，而另一条染色体上无T-DNA插入，不仅能扩增出以LP+RP为引物的条带，还能扩增出以BP+RP为引物的条带(两条带)。PCR反应体系 (20 μL)：0