FGF1通过miR-150对高糖诱导的HK-2人肾小管上皮细胞凋亡及纤维化因子表达的影响.docx

? ? FGF1通过miR-150对高糖诱导的HK-2人肾小管上皮细胞凋亡及纤维化因子表达的影响 ? ? 任欣会， 原霞 糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是严重的糖尿病合并症，是导致终末期肾病的主要原因(占30%～47%)[1-2]。DN的病理特征是细胞外基质和蛋白质[包括纤连蛋白(fibronectin, FN)和胶原蛋白(collagen)]的积累，肾小球膜增厚以及进行性系膜肥大[3]。高血糖引起的代谢损伤对DN的发展至关重要[1]，DN引起的肾功能障碍与肾小球系膜和肾小管间质的细胞外间质沉积，最终导致肾小管间质纤维化和肾小球硬化[4-5]。目前针对DN的治疗方法有限。因此，进一步明确DN发病的分子机制，筛选DN的候选治疗靶点，具有重要临床意义。 成纤维细胞生长因子1(fibroblast growth factor 1, FGF1)属于FGF家族之一，参与细胞的有丝分裂调节，在冠心病、心肌缺血、神经损伤和伤口愈合等方面均发挥作用[6]。FGF1还能通过调节葡萄糖及脂质代谢，参与肥胖和糖尿病的调节[7-8]；可通过调控氧化应激、炎症因子释放、单核苷酸多态性等抑制DN的发生[9-11]。研究发现，FGF1的表达受微小RNA(microRNA, miRNA)的调控，影响心肌纤维化[12]、肺纤维化[13]；异常表达的非编码RNA(non-coding RNA, ncRNA)，特别是miRNA与DN的发生和发展密切相关，可作为DN的诊断标志物[14]。通过基因表达数据库(gene expression ominibus, GEO)分析发现，FGF1在DN中显著下调，hsa-miR-150在DN中显著上调；抑制miR-150的表达可显著改善慢性肾病及肾纤维化损伤[15]。FGF1是否通过miR-150的表达影响高糖刺激肾小管上皮细胞凋亡及纤维化，目前还未见报道。因此，本研究拟构建HK-2细胞高糖损伤模型，观察FGF1对HK-2细胞凋亡及纤维化的影响及其与hsa-miR-150表达的相关性。 1 材料与方法 1.1 材料 人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2细胞)(中国科学院细胞库)；Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒、细胞周期检测试剂盒、RIPA细胞快速裂解液、BCA试剂盒及双荧光素酶报告基因检测试剂盒(武汉灵思生物技术有限公司)；MEM/F12培养基、无糖MEM/F12培养基、Lipofectamine 3000转染试剂(美国Gibco公司)；优质胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox Plus)(上海捷瑞生物工程有限公司)；兔抗FN抗体、兔抗collagen Ⅰ(Col-1)抗体、兔抗collagen Ⅳ(Col-4)抗体及兔抗转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)抗体(英国Abcam公司)；GAPDH及HRP酶标抗兔二抗(武汉Proteintech公司)；hsa-miR-150 mimics、hsa-miR-150 inhibitor及miRNA-NC(广州锐博生物技术有限公司)；pCDNA3.1-FGF1及pRL-TK- FGF1(WT)、pRL-TK- FGF1(MUT)表达载体(武汉灵思生物技术有限公司)。qRT-PCR 引物序列如表1， 序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 表1 引物序列 1.2 方法 1.2.1 GEO数据分析 选择GEO数据(GSE1009[16]、GSE51674[17])，利用GEO2R筛选差异基因[筛选标准：|log2Fold Change|(|log2FC|) 1，P 1.2.2 高糖损伤模型构建 HK-2细胞复苏后，待其黏合度达90%以上时，Reference[5,18]的方法，将HK-2细胞分组：NG组(含5.5 mmol/L葡萄糖的培养基培养)、OS组(含5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇的培养基培养)、HG组(含25.0 mmol/L葡萄糖的培养基培养)，连续培养24 h后，收集细胞进行检测。 1.2.3 细胞转染 参照脂质体Lipofectamine 3000转染试剂盒操作说明书，采用Lipofectamine 3000转染试剂将pCDNA3.1-FGF1、pCDNA3.1-vector分别与hsa-miR-150 inhibitor共转染HK-2细胞6 h 后，按照1.2.2构建高糖损伤模型。 1.2.4 细胞活力检测 收集细胞，按照试剂盒操作说明，每孔加入10 μL CCK-8溶液， 在细胞培养箱内继续孵育0.5 h，用酶标仪(450 nm)检测各组细胞