农林牧渔无菌微生物检查法方法学验证实例.pptxVIP

农林牧渔无菌微生物检查法方法学验证实例;方法：中国药典2005版无菌检查中薄膜过滤法方法验证 验证试验用菌种：验证试验用菌种包括金黄色葡萄球菌（26003）、铜绿假单胞菌（10104）、枯草芽孢杆菌（63501） 、生孢梭菌（64941）、白色念珠菌（ 98001）、黑曲霉菌（98003），来自中国医学细菌保藏中心。;菌液制备：;取经34℃培养18～24小时的生孢梭菌硫乙醇酸盐液体培养物1ml ，加入9ml 0.9%氯化钠溶液中，10倍稀释至10－7备用。 取经培养一周的黑曲霉斜面培养物，加 0.9%氯化钠溶液3ml，洗下孢子，转移至另一空管，标准比浊管比浊后，取1ml加入9ml 0.9%氯化钠溶液中10倍稀释至10－4约为50～ 100cfu/ml备用。;供试液制备：取样品10瓶分别加0.1%蛋白胨溶液30 ml溶解后，过滤。 7. 活菌计数 活菌计数结果见表1。;;方法验证;薄膜过滤法：;2023-07-19;2023-07-19;2023-07-19;结论： 根据上述结果，由于采用直接接种法进行虎杖苷注射液的无菌检查，存在对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌生长的抑制作用。因此，虎杖苷注射液的无菌检查应依据中国药典无菌检查方法中的薄膜过滤法进行，冲洗量规定为500ml。;头孢噻肟钠无菌原料的无菌实验方法验证;验证试验用菌种：;仪器和滤器：HTY-2000A集菌仪，全封闭无菌试验过滤培养器（批北京牛牛基因有限公司。;操作方法;取经32.5±2.5℃培养19~21h小时的大 肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单孢菌肉汤培养物1ml，加9ml生理盐水，10倍稀释至约10-5~10-8之间。 取经36℃培养18~22h的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养基培养物1ml，加9ml生理盐水，10倍稀释至10-6，混匀备用。;白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中[见附录1.3], 25.5±2.5℃培养24～48小时。 取经25.5±2.5℃培养72小时的白色念珠菌真菌斜面培养物，加入生理盐水4ml洗下孢子，吸出转移至空试管作为原液，取1ml加 9ml生理盐水，10倍稀释至10-6，取1.2ml加生理盐水9ml，混匀备用。;将黑曲霉菌斜面的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，25.5±2.5℃培养5～7d，使大量的孢子成熟。取经25℃培养7d的黑曲霉真菌斜面培养物，加入 生理盐水4ml洗下孢子，吸???转移至空试管作为原液，稀释至10-4，取0.5ml加生理盐水10ml混匀备用。;菌液计数：分别取上述5种细菌菌液1ml加 入培养皿，每种菌液做平行2皿。注入营养琼脂约18ml。30~35℃培养（生孢梭菌置 厌氧培养箱中培养）。分别取上述2种真菌菌液1ml加入培养皿，每种菌液做平行2皿。注入虎红琼脂约18ml。23~28℃培养。;供试液制备：每2支以100ml生理盐水溶解，混匀备用。 薄膜过滤：将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，每次50ml，在最后一次的冲洗液中逐一加入试验菌少于100CFU。按规定将培养基直接 加至滤筒内。每天观察并记录结果。;阳性对照：另取滤筒，不过滤供试品，其它操作同上，作为阳性对照，将含培养基的容器按规定温度培养3～5天。各试验菌及相应的培养基逐一进行验证。取未加样品的滤器分别加硫乙醇酸盐流体培养基5桶及真菌培养基2桶，100ml/桶。 阴性对照：两个滤器桶内各过滤生理盐水200ml，然后分别加入硫乙醇酸盐培养基和真菌培养基各100ml，不加对照菌液 ，分别于30-35℃及23-28℃培养。;培养：硫乙醇酸盐流体培养基桶30-35℃培养；真菌培养基桶23-28℃培养。观察结果。 结果 细菌和真菌数计数结果分别见表1和表2 。;表1 细菌数计数;实验结果见表3和表4;表4 36小时观察真菌结果;大肠埃希菌菌液制备：取经35℃培养 19~20h 的大肠埃希菌肉汤培养物1ml，加 9ml生理盐水，10倍稀释至10-6，取0.4ml加盐水10ml混匀，做活菌计数备用。;表5 实验结果（大肠埃希菌菌数54CFU）;结论： 头孢噻肟钠无菌原料无菌检查法:,取样量 3.0克，采用薄膜过滤法（封闭滤器为北京牛牛基因技术有限公司生产）。冲洗液为 0.9％的氯化钠溶液，冲洗量800ml，加酶 量2支（大于300单位/ml）以大肠埃希菌为阳性对照菌。;复方磷酸可待因（欧博士止咳露）溶液微生物限度检查法验证实验;具体操作方法;取经25 ℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，加3~5ml盐水洗下霉菌孢子，吸取出菌液，用标准比浊管比浊，然后取1 ml +9 ml盐水，逐管10倍稀释为10-4，细菌数约为 50~100cfu/ml，做活菌计数备用。 供试液制备： 吸取样品10 ml ，加0.1%