DB37_T 3375-2018小麦黄花叶病毒、中国小麦花叶病毒检测技术规程.pdf

ICS65.020B 01DB37山長东省地方标准DB 37/T 3375—2018小麦黄花叶病毒、中国小麦花叶病毒检测技术规程Detection and identification of wheat yellow mosaic virus and Chinese wheat mosaicvirus2018-07-19发布2018-08-19实施山东省质量技术监督局发布 DB37/T言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省农业厅提出。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院植物保护研究所。本标准主要起草人：吴斌、幸相启、要珊珊、张眉、王升吉、辛志梅。I DB37/T 3375—2018小麦黄花叶病毒、中国小麦花叶病毒检测技术规程1范围本标准规定了小麦黄花叶病毒、中国小麦花叶病毒的间接ELISA、Dot-ELISA和普通RT-PCR检测方法。本标准适用于冬小麦叶片组织中小麦黄花叶病毒、中国小麦花叶病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14926.50实验动物酵联免疫吸附试验SN/T 1193基因检验实验室技术要求SN/T 2964植物病毒检测规范SN/T 1666水稻条纹病毒、水稻矮缩病毒、水稻黑条矮缩病毒的检测方法普通RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法33术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1小麦黄花叶病毒wheat yellow mosaic virus (WYMV)马铃薯Y病毒科（Potyviridae），大麦黄花叶病毒属（Byapvirus），病毒粒子、传播途径及危害：病毒粒体线状，病毒基因组由两条单链正义RNA组成，在自然界中由禾谷多黏菌（PolymyxagrainisL.）穗短小，甚至出现畸形穗，籽粒不饱满，导致产量和品质下降。3. 2中国小麦花叶病毒Chinese wheat mosaic virus (CWMV)真菌传杆状病毒属（Furovirus），病毒粒子、传播途径及危害：病毒粒体杆状，病毒基因组由两条单链正义RNA组成，在自然界中由禾谷多黏菌（PolyayxagrawinisL.）在土壤中传播，侵染冬小麦造成叶片褪绿、黄化、分策增生、植株矮缩，严重时死亡。3. 3酶联免疫吸附测定enzyme linked immunosorbent assay, ELISA具体描述参照GB/T14926.50。1 DB37/T 337520183. 4间接酶联免疫吸附测定indirect enzyme linked immunosorbent assay, IELISA简称：IEISA，首先用样品中抗原包被于固相载体，经洗涤，加入相应病毒的抗体，形成待测抗原抗体复合物，再经孵育洗涤后，加入酶标记二抗，形成固相抗原-抗体-酵标二抗复合物，测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。3. 5 斑点酶联免疫吸附测定dot enzyme linked immunosorbent assay, DotELISA以纤维素膜代替免疫酶固相载体法中常用的聚苯乙烯微量反应板而建立的一种免疫检验方法。不仅保留了常规ISA的优点，而且还弥补了抗原或抗体对载体包被不年等不足，所以具有敏感性高，特异性强，被检样品用量少，节省材料，不需特殊仪器，结果判定简单易行和便于长期保存等特点。Dot-ELISA的基本原理与常规ELISA基本相同，即将抗原或抗体首先吸附在纤维素薄膜（如硝酸纤维素膜）表面，并保持其免疫活性，通过与相应的抗体或抗原和酵标记物的一系列免疫反应，形成酶标记抗原抗体复合物，在底物的参与下，结合物上的酵催化底物使其水解、氧化成另一种带色物质，沉者于抗原抗体复合物吸附的部位，呈现出肉眼可见的颜色斑点。试验的结果通过颜色斑点的出现与否和色泽深度进行判定。3. 6逆转录-聚合酶链式反应reverse transcription polymerase chain reaction, RTPCR简称RT-PCR。具体描述参照SN/T1666.4方法原理小麦黄花叶病毒、中国小麦花叶病毒的血清学特性与分子生物学特性是该病毒检测方法的主要依据。两种病毒都具有很强的免疫原性，同时都是RNA病毒，因此可利用间接ELISA、Dot-ELISA和RT-PCR方法确定样品中是否带有上述两种病毒。55主要仪器设备、用具和试剂5.1仪器和设备：a)酶标仪：洗板机：c)电子天平（感量0.001g）：d) PCR 仪:e)电泳仪：f)水平电泳槽：g)凝胶成像仪：h)高速冷冻离心机