DB37_T 1827-2011猪圆环病毒2型荧光PCR检测技术.pdf

ICS B4165. 020. 30DB37山东省地方标准DB37/T 1827—2011猪圆环病毒2型荧光PCR检测技术Real-time PCR Assay for the Detection of Porcine Circovirus Type 22011-0408 发施山东省质量技术监督局发布 DB37/ T XXXX—XXXX前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准的附录A为规范性附录。本标准由山东省农业科学院提出。本标准由山东省畜牧业专业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所，本标准主要起草人：王金宝、李俊、吴家强、时建立、吴晓燕、丛晓燕、孙文博、杜以军，I DB37/ T XXXX—XXXX猪圆环病毒2型荧光PCR检测技术1范围本标准规定了猪圆环病毒2型(PCV2)荧光PCR检测技术的要求。本标准适用于猪血清和组织中猪围环病毒2型的检测。2材料2. 12. 1.1微量移液器（最大量程为10μL、20μL100μL、1000μL)2.1.220000g高速冷冻离心机2.1.3紫外分光光度计2. 1. 4PCR 仪2. 2荧光定量PCR仪试剂2. 2.1质粒提取试剂盒2. 2.2SYBR GreenI核酸染料2. 2.3凝胶回收试剂盒2. 2. 4蛋白酶K(见附录A.1章)2. 2.510%SDS液（见附录A.2章）2. 2. 670%乙醇（见附录A.3章）2.2.71%琼脂糖凝胶（见附永A.4章）2. 2.8DNA Marker 20002. 3引物Y1: 5′GCTGATTTCTTTTGTTGTTTGGTT3Y2: 5°GAGTGGGCTCCAGTGCTGTTAT3*3方法3.1质粒标准阳性模板的制备3.1.1质粒的构建及鉴定利用普通PCR技术扩增出PCV2的0RF2基因702bp片段，滤胶回收后克隆到克隆载体。纯化质粒，并转化DH5α感受态细胞，挑选转化长出的菌落进行培养，提取质粒进行PCR鉴定，3.1.2重组质粒浓度的测定将阳性重组质粒作20倍稀释，用紫外分光光度计测定其浓度，并计算标准品的拷贝数。3.1.3标准品制备将重组质粒稀释至1.0×10拷贝/μL后再倍比稀释，分别以10、10°、10°、10°、10°拷贝/μL5个梯度作为标准品模板，-70℃保存备用。1 DB37/ T XXXX—XXXX3. 2病毒基因组的提取对病料用蛋白酶K裂解法提取总DNA。3. 2.1病料处理：取小块病料组织于研体中，用剪刀剪碎，加入2mLPBS缓冲液，研磨。3.2.2取研磨液500μL于1.5mL离心管中，加入50μg/mL的蛋白酶K5μL，加入10%的SDS溶液25μL,55C水浴23h.加入200μLTris饱和酚，充分混匀，10000g离心15min。3. 2. 4取上清于一新的离心管中，加入200μlTris饱和酚和200μl氯仿，10000g离心15min。3. 2. 5取上清于一新离心管中，加入200μL氧仿，10000g离心15min。3. 2. 6取上清于一新离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，-20C静止20min，10000g离心15min，弃上清，3. 2.7加入70%的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干，8加入100μL灭菌超纯水溶解沉淀，-20℃保存备用。3. 3荧光定量PCR体系，详见表1。表1荧光定量PCR反应体系步骤1SYBR GreenI枝酸染料12. 5 μ L步巢2引物丫11. 0 μ L步靴3引物Y21. 0 μ L步攀4DNA2. 0 μ L步骤5超纯水8. 5 μ L总量25. 0 μ L荧光定量PCR程序设定每次PCR均应设没一个阴性对照，具体参数见表2。表2荧光定量PCR反应程序设定时间步骤195*C3min步巢23.9610s59°C收集信号10s步骤30.562nin3.0920s95CCont inue4结果判定读取检测结果。阀值设定原则以阔值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点。4. 1标准曲线选择10°、10°、10°、10°、10°拷贝/μL5个梯度浓度的质粒作为模板，制作出动力学曲线和标准曲线。建立的标准曲线斜率为-3.304，轴截距为39.051，线性方程为Y=-3.394X+39.051，相关系数为0.994.荧光定量PCR能检测出的模板最低浓度为10拷贝/μL，而且不能扩增出PCV1、PPV、PRV病毒DNA，有很好的特异性。4. 2质控标准2 DB37/ T XXXX—XXXX4.2.1阴性对照无Ct值并且无扩增曲线，4.2.2阳性对照Ct值≤35，并出现特定扩增曲线。否则，则此试验视为无效。4.3结果描述及判定4.3.1阴性无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无PCV2病