DB37_T 4044-2020禽腺病毒4型荧光定量PCR检测方法.pdf

ICS 11. 220B 41DB37山長东省地電方标准DB37/T4044—2020禽腺病毒4型荧光定量PCR检测方法Real-time PCR assay for the detection of fowl adenovirus serotype 42020-07-09发布2020-0809实施山东省市场监督管理局发布 DB37/T 4044—2020前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学家禽研究所。本标准主要起草人：孟凯、吴家强、袁小远、宋敏训、张玉霞、杨金兴、艾武、元丽红。I DB37/T腺病毒4型荧光定量PCR检测方法1范围本标准规定了禽腺病毒4型（FAdV-4）荧光定量PCR检测方法。本标准适用于鸡咽喉和泄殖腔拭子及肝脏组织中FAdV-4的检测2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3试验原理实时荧光定量PCR检测是在PCR反应体系中，除采用特异的引物外，还加入了与DNA双链非特异性结合的SYBRGreenI荧光染科。当它与DNA双链结合时，发出荧光，从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。随着PCR反应的进行，每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。4试剂或材料除非另有说明，在分析中仅使用分析纯的试剂，水为GB/T6682规定的一级水，4.110×磷酸盐缓冲液PBS：pH值7.2。4.2研体。4.3病毒DNA提取试剂盒。4. 4SYBR Green I qPCR 混合物4.5阳性对照：浓度为1.0×10拷贝/μL的阳性质粒，4. 6阴性对照：水。4. 7DEPC 水.5仅器设备5.1微量可调移液器：最大量程为10μL、20μL、100μL、1000μL5.21台式低温高速离心机：最高转速16000r/min。5.32分析天平：精度为0.01g-5.4荧光定量PCR仪：温度范围4.0℃~99.9C.5.5冰箱：规格为4℃和-20℃。5. 6二级生物安全柜。 DB37/T 4044—20206引物P1: 5 GTCTATACCAACACGAGCACC3P2:5TTTTGTACCCGTCGCAGAG37样品7.1采集工具棉拭子，剪刀，锻子，1.5mL离心管，7. 2样品采集7.2.1咽喉拭子/泄殖腔拭子7.2.1.1咽喉拭子采样：将棉拭子深入喉头来回刮3次，取咽喉分泌液，放于含抗生素（青霉素2000U/mL+链毒素2mg/mL）的10×磷酸盐缓冲液PBS（pH值7.2）的1.5mL离心管中。7.2.1.2泄殖腔拭子采样：将棉拭子深入泄殖腔转一圈活取粪便（需有可见黄便），放于含抗生素（青莓素10 000 U/mlL+链莓素10 mg/mL）的PBS 中。7.2.2组织样品待检禽无菌采集整个肝脏，装入一次性采样袋或其他灭菌容器，编号。7.3样品运输与保存样品放于保温箱中加冰，密封，24h内送至实验室，如不能立即检测，需将样品放于-20℃冰箱保存。7.4样品处理7. 4. 1[咽喉拭子/泄殖腔拭子将装有咽喉拭子/滑殖腔拭子的1.5mL离心管在振荡器上充分混合后，取出棉拭子，4C条件下5000r/in离心10min，取上清液转入新的1.5mL离心管中，编号备用。7.4.2组织样品将组织置于灭菌的研钵中，按照质量体积比（1：510）加入灭菌PBS进行充分研磨，4C条件下5000r/min离心10min，取上清液转入新的1.5mL离心管中，编号备用。试验步骤8.1病毒DNA提取用病毒DNA提取试剂盒，按照说明书步骤提取待检样品的DNA。病毒DNA提取成功后置于-20C保存备用。8. 2荧光定量PCR反应体系详见表1.2 DB37/T 4044—2020表1荧光定量PCR反应体系试剂使用量SYBR Green I qPCR 混合物10 μ LPCR Forvard Priner (10 μmol/L)1 μLPCR Reverse Priner(10μ mo1/L)1 μ LDNA 模板2 μ LDEPC 水6 μLTotal20 μ L每次均应设阴性对照。*内含DNA聚合酶，dNTP Mixture, )Mg和荧光染料SYBR Green.荧光定量PCR反应程序设定详见表2。表2荧光定量PCR反应程序设定阶段1：预变形阶段2：PCR反应阶段3：溶解典线分析95 °C, 5 sec95 C, 5 sec95 C, 1 mi