DB37_T 3893-2020芋头病毒检测技术规程.pdf

ICS65. 020B 16DB37山瀘东省地方标准DB37/T3893—2020芋头病毒检测技术规程Detection and identification of taro viruses2020-03-31发布2020-05-01实施山东省市场监督管理局发布 DB 37/T 3893—2020前 言本标准由山东省农业农村厅提出。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院植物保护研究所，本标准主要起草人：姜珊珊、辛相启、吴斌、张眉、王升吉、辛志梅。I DB 37/T 3893—2020芋头病毒检测技术规程1范围本标准规定了芋花叶病毒（Dasheenmosaicvirus，DsMV）和黄瓜花叶病毒（CucumbermosaicvirusCMV）的RT-PCR的检测方法。本标准适用于芋头叶片中芋花叶病毒和黄瓜花叶病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3检测对象3. 1芋花叶病毒中文名：芋花叶病毒学名： Dasheen mosaic virus缩写：DsMV分类地位：马铃薯Y病毒科（Potyviridae），马铃薯Y病毒属（Potyvirus）病毒粒子、传播途径及危害：病毒粒子呈线状，长度约为750nm。一般通过蚜虫传播，还可通过机械摩擦传播。感染DsMV的芋头植株通常表现为叶片花叶、斑驳、皱缩卷曲、叶脉黄化和茎坏死等症状3.2黄瓜花叶病毒。中文名：黄瓜花叶病毒学名： Cucumber mosaic virus缩写：CMV分类地位：雀麦花叶病毒科（Bromoviridae），黄瓜花叶病毒属（Caucamovirus）病毒粒子、传播途径及危害：病毒粒子为球状，直径28nm～30nm。主要由蚜虫以非持久性方式传播。导致寄主出现花叶、黄化、皱缩等症状。t主要仪器设备、用具和试剂4.1仪器设备和用具仪器设备和用具主要有：a)PCR仪：b)电泳仪：c)水平电泳槽： DB 37/T 3893—2020d)凝胶成像仪：e) 高速冷冻台式离心机：f)纯水仪：g)万分之一天平：h)普通冰箱（0℃~4℃）：i)-20℃低温冰箱；j)-70℃低温冰箱；k)磁力搅拌器：1) 高压灭菌锅：m)可调微量移液器（10μL、100μL、200μL、1000μL、5000μL）;n)RNase-firee 吸头 （10 μL、200 μL、1000 μL);(oRNase-free 离心管(1.5 mL,2.0 mL):p)RNase-free PCR 反应管。4. 2试剂所有实验用试剂均为分析纯：相关试剂配制方法详见附录A：除特殊说明外，均为符合GB/T6682实验用水为无菌超纯水或去离子水，4. 2. 1RNA提取试剂：a) 多糖多酚植物RNA提取试剂盒或其他等效产品：b)三氯甲烷：c) 异丙醇：d) 75%乙醇;e) RNase-free超纯水。4. 2. 2反转录试剂：a) 随机引物：b)RNase抑制剂：c)逆转录酵：AMV或其他等效：d)dNTPs (10 mM) :e) -20°C烂减。4. 2. 3PCR 试剂:a)DNA聚合酵试剂盒：2×EsTaqMasterMix或其他等效产品：b)DNA分子量标记物：100bp~2000bp：50×TAE缓冲液：c)核酸染料：Gelred（10000×）溶液或其他等效溶液：d)含10倍浓度Gelred的1%琼脂糖凝胶；e)6×DNA上样缓冲液。5RT-PCR检测方法5.1方法提要2 DB 37/T 3893—2020芋花叶病毒和黄瓜花叶病毒皆为RNA病毒，利用TransZolPlant多糖多酚植物RNA提取试剂盒进行RNA纯化，然后进行RT-PCR检测，通过琼脂糖凝胶电泳对检测结果进行判定。5.2样品采集观察芋头叶片是香出现叶脉褪绿、脉间褐绿黄化、叶片皱缩、花叶、叶片畸形等典型病毒病症状，取出现上述整状的样品装至无菌样品装中，标记样品编号、取样时间、取样地点，于低温条件下（2亡一8℃）运送至实验室，放置-70C超低温冰箱保存备用。样品避免反复冻融。以通过分子检测不含病毒的样品作为阴性对照，以确定感染DsMV或CMV的样品为阳性对照。以下操作对阴性对照、阳性对照进行同样处理。5.3RNA的提取和纯化5.3.1称取100mg样品置2ml离心管中，用液氮速冻后迅速研磨，然后加入1mL裂解缓冲落液（1ml/100mg样品），剧烈振荡混匀，室温放置5min4℃，13000pm离心5min。5.3.2取上清液于1.5mL离心管中，加等体积的缓冲液2，颠倒混勾后加入1/4体积三氯甲烷，再次顺倒混匀，