DB34T 1729-2012窖泥中脱氢酶活性的分析方法.docxVIP

ICS 安 DB34 徽 省 地 方 标 准 DB 34/T 1729—2012 窖泥中脱氢酶活性的分析方法 Method of analysis for dehydrogenase activity of Pid Mud 文稿版次选择 2012 - 11 - 06 发布 2012 - 12 - 06 实施 安徽省质量技术监督局 发 布 I DB34/T 1729—2012 前 言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由安徽古井贡酒股份有限公司提出并负责起草。 本标准由安徽省浓香型白酒标准化技术委员会归口。 本标准主要起草人：周庆伍、李安军、万春环、汤有宏、袁志强、刘国英、高江婧。 1 DB34/T 1729—2012 窖泥中脱氢酶活性的分析方法 1 范围 本标准规定了窖泥中脱氢酶活性的分析方法。 本标准适用于浓香型白酒窖泥中脱氢酶活性的分析。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 脱氢酶活性 dehydrogenase activity 在本方法规定的分析步骤条件下，每 1 g 绝干窖泥 l h 产生 1 μg 三苯基甲月替(TF)的量为一 个酶活力单位。 4 原理 利用无色的氯化三苯基四氮唑(TTC，2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride)， 接受氢后变 成红色的三苯基甲月替(TF， triphenyl formazan) ，根据产生红色进行比色定量分析， 以判断脱氢酶 活性。根据红色的深浅， 测出相应的吸光度(A值) ，求出脱氢酶活性。A值越大(红色深) ，脱氢酶活 性越高。TTC作为受氢体，其还原过程可用下式表示： 5 试剂 本标准所用水在未注明其他要求时，均指符合 GB/T 6682 中三级以上(包括三级)要求的水；本 标准中所用试剂，在未注明特殊要求时，均指分析纯(A.R)。 2 DB34/T 1729—2012 5.1 4 g/L TTC 溶液：准确称取 0.4 g(精确至 0.0001 g)TTC(2，3， 5-氯化三苯基四氮唑)和 2 g (精确至 0.01 g)葡萄糖溶于少量蒸馏水中，再稀释到 100 mL 的容量瓶中贮存于棕色瓶中，一周更 换一次。 5.2 Tris-HCl 缓冲液(pH = 8.16)：准确称取 6.0370 g(精确至 0.0001 g)Tris(三羟甲基氨基 甲烷)，再加入 20.0 mL 1.00 mol/L 的盐酸，再定容至 1000 mL。 5.3 0.36％ Na2SO3 溶液: 0.36 g(精确至 0.0001 g) 亚硫酸钠定容到 100 mL 容量瓶中。 5.4 连二亚硫酸钠。 5.5 0.9％生理盐水。 5.6 丙酮。 5.7 甲醛。 6 仪器 6.1 分光光度计。 6.2 数显水浴锅。 6.3 分析天平(感量 0.0001 g)。 6.4 离心机(4000 rpm)。 7 分析步骤 7.1 绘制 TTC 标准曲线 7.1.1 配制系列浓度的 TTC 标准溶液 先取 5 支 50 mL 具塞比色管， 按顺序尽快分别加入 0.36％Na2SO3 溶液(5.3) 2.50 mL，Tris-HCl 缓冲液(5.2)7.50 mL， 再分别吸取 4 g/L TTC 溶液(5.1) 0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、 0.40 mL、 0.50 mL，放入5支比色管中，用蒸馏水定容至 50 mL，使成 8 μg/mL、16 μg/mL、24 μg/mL、32 μg/mL、 40 μg/mL系列浓度。同时另取一支 50 mL比色管，加入 0.36％ Na2SO3 溶液(5.3)2.50 mL，Tris-HCl 缓冲溶液(5.2) 7.50 mL，加入蒸馏水至 50 mL，作为空白对照。 7.1.2 TTC 还原反应 取 6 支 10 mL 具塞比色管，分别吸取 5.00 mL 上述系列溶液(按浓度从小到大顺序依次吸取)， 向每支比色管中各加入 0.10 g 连二亚硫酸钠(5.4)粉末混匀，使 TTC 全部还原成红色的 TF。 7.1.3 测定吸光度 向上述各管加入 0.50 mL 甲醛终止反应，摇匀后加入 5.00 mL 丙酮振荡摇匀， 37℃水浴 10 分钟； 4000 rpm 离心 5 分钟， 吸取上清液 5.00 mL 在 485 nm 波长下测定吸光度A值，比