DB37_T 3105-2018向日葵种子纯度蛋白电泳检测标准.pdf

ICS 67. 060B21DB37山東东省地方标准DB37/T3105—2018向日葵种子纯度蛋白电泳检测标准The variety purity identification technique of sunflower seeds with 02-02发布2018-03-02实施山东省质量技术监督局发布 DB37/T 3105—2018前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省农业厅提出。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东农业大学、北京德农种业有限公司。本标准起草人：张者庆、赵洪、郑建朋、温大兴、季岩，本标准为首次发布。I DB37/T 3105—2018向日葵种子纯度蛋白电泳检测标准1范围本规程规定了蛋白质电泳的试剂配比、蛋白质提取、凝胶制备、电泳、染色、判别分析等技术要求、本规程适用于向日葵品种及杂交种种子的纯度室内的快速鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件，GB3543种子检验技术规程GB20464农作物种子标签通则3术语和定义下列术语和定义适用于本文件，3. 1杂交种各种直接用于生产的杂交向日葵一代种子。3. 2品种纯度品种在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示，3. 3标准样品能够充分代表种或品种特征特性的种子样品，或具备指定特征、特性样品。4原理4.1不同品种遗传组成不同，在种子形成时期合成的蛋白质不同。4.1.1不同的蛋白质由于分子大小、形状不同，在一定的H条件下所带的电间多少不同，因此在电场作用下，在凝胶中移动的快慢不同，通过电泳可以把不同的蛋白质区分开，近而区分不同的亲本和杂交种.4.1.2利用该电泳技术，杂交种具有不育系和恢复系的双亲谱带，双亲有差异蛋白谱带是杂交种纯度检测的关键位置。1 DB37/T 3105—20184.2蛋白谱带的命名方法：以点样孔为零点，在胶中部每个样品都含有的条带为50（图1），在0～50之间细分为50等份作为标尺，50以下的部分按该标尺进行区分，读取泳道内所有蛋白指纹所处位置的数值，记为蛋白质谱带名称。88图1蛋白质谱带命名示意图5仪器与试剂5.1仪器单粒种子磨粉器，天平（感量0.0001g，0.001g），移液管（10mL），离心管（1.5mL），离心管架，容量瓶（100ml、500mL、1000mlL），微量进样器（1μL100μL），离心机，双垂直板电泳槽，电泳仪，恒温箱，电冰箱，规片灯，5.2试剂丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，冰醋酸，过硫酸铵，尿素，四甲基乙二胺（TEMED)，三氯乙酸，考马斯亮蓝R-250，十二烷基磺酸钠(SDS)，无水乙醇（所用试剂均为分析纯，所用水均为去离子水）。6溶液6.12% SDS称取2gSDS倒入100mL烧杯中，加入去离子水溶解，加去离子水定容至100mL，转入试剂瓶，4℃产存备用。6.2蛋白提取液2 DB37/T取18g尿素，加的50mL去离子水落解后加12mL冰乙酸，3mL四甲基乙二胺，7.5mL2%SDS，加去离子水定容至100mL，转入试剂瓶并加入0.05g甲基绿，4℃贮存备用。6.3凝胶落液称取50g丙烯酰胺、50g尿素、1.0g甲叉双丙烯酰胺，加去离子水溶解后加入15mL冰乙酸，0.10g确酸亚铁，加去离子水定容至500mL，4C忙存备用。6.4催化剂溶液称取1.75g过硫酸铵，加去离子水溶解并定容至50mL，4C短期贮存。6.5电极缓冲液量取20mL冰乙酸加水定容至1000mL。6.6染色液称取0.4g考马斯亮蓝R-250，用25mL无水乙醇溶解，倒入染色盘，加50g～60g三氯乙酸，加去离子水500ml，搅匀。7操作程序7.1蛋白质提取离心管中，按向日要募种子与提取液质量体积比1：6加蛋白提取液、播匀，25C提取20min，用离心机4000g离心4min，取上清液备用，7.1.2与标签值比较时，为了减少工作量，可以顺序测定50粒/次，将测定结果与标签值比较是否在允许误差范围内。7.2凝胶制备将洗净晾干的玻璃板采用水平平板灌胶的方式组装玻璃板，用铁夹固定，取40mL凝胶溶液于烧杯中，加65μL～80μL催化剂溶液，迅速搅勾沿玻璃棒向玻璃板中倒满凝胶溶液，迅速插入样品梳，2min~3min聚合后将样品梳拔出，吸出样品槽中的水分，将玻璃板固定在电泳槽内。7.3点样用微量移液器取离心后的样品上清液30μL加入样品槽，每加一个样品后，用去离子水清洗移液器两次。7.4电泳加样完毕后，加入2%电极缓冲液，上槽电极缓冲液要没过矮玻璃板，下槽电极缓冲液要没过玻璃板，将电源线正极