DB11T 507-2007玉米品种纯度及真实性SSR分子检测方法.pdf

ICS 65. 020. 20B 21备案号：215322007DB北京市地方标准DB11/T 507—2007玉米品种纯度及真实性SSR分子检测方法SSR-based Method to Assay Purity and Genuineness in Zea mays L2007-11-22发布2008-02-01实施北京市质量技术监督局发布 DB11/T 507—2007前言本标准的附求A为规范性附永，附求B为资科性附永，本标准由北京市农业局提出。本标准由北京市农业标准化技术委员会种植业分会归口。本标准起草单位：北京市种子管理站、北京市农林科学院玉米研究中心、全国农业技术推广服务中心.本标准主要起草人：贾希海、郭景伦、辛景树、律宝春、田雷、吴明生、赵久然、王风格、云晓、郭慧杰。 DB11/T507—2007玉米品种纯度及真实性SSR分子检测方法1范围本标准依据SSR分子标记原理，规定了进行玉米单交种和亲本自交系的品种纯度及真实性检测方法的仪器设备及试剂、引物筛选、试验步骤、纯度检测和真实性鉴定。本标准适用于玉米单交种及亲本自交系的纯度及真实性检测。2术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2. 1品种纯度varietalpurity品种在DNA分子标记带型方面典型一致的程度，用供检样品中本品种的种子数占样品种子总数的百分率表示。2. 2品种真实性varietalgenuineness供检品种与标准品种的符合程度。2. 3SSR分子标记simple sequence repeat marker由寡核苷酸为单位的简单串联重复序列，2. 4引物primer结合在模板DNA上的互补短链，提供3’-OH末端作为DNA合成的起点，延伸合成模板DNA的互补链.3原理在玉米基因组中普遍存在着由寡核苷酸为基本单位的简单串联重复序列，品种间因其重复次数不同而存在多态性，据此可以利用适宜引物进行PCR扩增，从而检测出特定SSR位点的多态性，以鉴别品种的纯度及真实性，4仪器设备及试剂4.1仪器设备PCR扩增仪：DNA序列分析电泳槽：高压电泳仪（3000V，400mA，400W)；电子天平（感量0.01g，察灯：水平糯床：高压灭菌锅：酸度计等。烧杯：锻子：刻刀：量筒：容量瓶（500mL，1000mL)：离心管（0.5mL，1.5mL)：吸头（10μL，200uL，1000μL）：注射器（100mL）：96孔深孔板：96孔PCR板：封板膜：一次性手套：离心管架：染色盒（55cmX38cm×8cm)：水平仪：夹子等。4.2试剂乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na;)；三羟甲基氨基甲烷（Tris)；盐酸（HC1，36%)：氢氧化钠(NaOH)：10倍PCR缓冲液（不含Mg），保存条件为-20C：氯化镁（MgC1:)：四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs），保存条件为-20C：TagDNA聚合酶（5U/μL)，保存条件为-20C：SSR引物，保存条件为-20C：矿物油：- DB11/T 507—2007去离子甲酰胺：溴酚蓝：二甲苯青FF；甲叉双丙烯酰胺：丙烯酰胺：硼酸：尿素：亲和硅烷（BindingSilane)：剥离硅烷（RepelSilane)：无水乙醇：四甲基乙二胺：过硫酸铵：冰醋酸：硝酸银：甲醛溶液等。DNA提试剂、PCR反应试剂、电泳试剂和银染试剂的成分及配制按附录A执行。5引物筛选适宜引物筛选应遵守扩增后的杂交种SSR电泳谱带含有双亲谱带，而且带型清晰、重复性好的质则.可以利用已经公开发表的引物，也可以自行筛选引物。自行筛选时，取测试杂交种种子10粒及父母本种子各5粒，利用一系列引物进行分析，从中确定适宜的引物。常见适用于玉米品种的纯度及真实性分析的SSR引物名称及序列参见附录B6方法步骤6.1DNA提取剥取种胚，分别放入96孔深孔板中，每孔加入150μuLDNA提取液，盖封板膜，煮沸5min后，在每孔中加入150μLTE缓冲液，形成样品DNA溶液。样品DNA溶液可以直接进行PCR扩增或在冰箱中冷冻长期保存，6.2扩增(25 mmo1/L), 1. 2μL dNTP (2. 5 mmo1/L) , 0. 25μL SSR 引物 (20 μmo1/L), 0. 25μL TaqDNA 聚合酵 (5U/μL) ,混匀。每孔再加入2μL样品DNA溶液和1滴矿物油，盖封板膜后放入PCR仪，扩增程序为：94C预变性5min94C变性40s，60℃C退火35s，72℃延伸45s，循环35次；72C延伸5min；4℃保存，6.3检测6.3.1胶板制作将玻璃板洗净，用无水乙醇擦洗两避，干燥。在长玻璃板上涂0.5%亲和硅烷（BindingSilane）0.5mL，带凹槽的玻璃板上涂2.0%刹离硅烷（RepelSilane）0.5ml。操作过程中防止两块玻璃板互相污染。