SN_T 3307-2012口岸食源性疾病腺病毒PCR检测方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3307—2012口岸食源性疾病腺病毒PCR检测方法PCR method of adenovirus for foodborne disease at frontier port2013-07-01实施2012-12-12 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局金蔡德真# SN/T 3307—2012前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国江西出人境检验检疫局。本标准主要起草人：关淳、赵良娟、王乃福、曲鹏、黄晶晶、高旗利。I SN/T 3307—2012口岸食源性疾病腺病毒PCR检测方法1范围本标准规定了口岸食源性疾病腺病毒40型和 41型PCR检测方法、结果判定及报告及生物安全措施。本标准适用于检验检疫机构对口岸食源性疾病腺病毒40型和41 型的检测和报告。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注白期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析试验室用水规格和实验方法GB19489实验室　生物安全通用要求SN/T 1193基因检验实验室技术要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1腺病毒 adenovirus属于腺病毒科,无包膜的双链 DNA 病毒,基于生物和遗传特征,共有 51 个血清型,分属 A～F 6 个亚属，F亚属包括腺病毒40型和41型，称为肠腺病毒，肠腺病毒是引起儿童食源性病毒腹泻的重要病原体。病毒颗粒呈球形,直径 70 nm～90 nm,病毒体呈类,似通讯卫星样结构。腺病毒对酸碱及温度的耐受范围较宽，对脂溶剂有较强的抵抗力，紫外线照射30jmin 或56℃，3gmin 可被灭活。4设备4.1高速冷冻离心机：最大离心力13000g。4.2 PCR扩增仪。4.3电泳仪。4.4空气浴振荡摇床:200 r/min。4.5凝胶成像系统。可调移液器:0.1 μL～2 μL,1 μL～10 μL,20 μL～100 μL,100 μL～1 000 μl。4.64.7水浴锅。4.8低温冰箱：一20℃和-80℃。4.9匀浆器。4.10制冰机。4.11高压灭菌锅。4. 12生物安全柜。 SN/T 3307--20125 主要试剂除另有规定外，试剂为分析纯，实验用水均为灭菌双蒸水，规格符合GB/T6682一级水的要求。5.1 Taq DNA 聚合酶。5.2 dNTP:dATP、dTTP.dCTP.dGTP。5.3 琼脂糖。5.4限制性内切酶Rsa I。5.5 PEG 8 000 溶液:16% PEG 8 000、0.3 mo1/L 氯化钠。5.6匀浆缓冲液:0.1mol/L磷酸氢二钠、0.3mol/L氯化钠、pH9.6。5.7溴化乙锭。5.8相对分子质量标准：50 bp DNA ladder 和100 bp DNA ladder。5.9柱式病毒 DNA 提取试剂盒。5.10PCR产物纯化试剂盒。5.11 PBS缓冲液:pH7.4。5.12 TE缓冲液:10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、pH8.0。5. 13 10XPCR 缓冲液:200 mmol/L Tris-HCI、200 mmol/1. KCI、15 mmol/L MgCl2~pH8.4。5.145×TBE电泳缓冲液:Tris 54 g、硼酸 27.5 g、0.5 mol/L EDTA 20 mL,加蒸馏水至 1000 mL,pH8.0。使用时稀释为 0.5×TBE电泳缓冲液。5.15质控样品：用含腺病毒目的基因的质粒作为PCR的阳性对照；不含腺病毒目的基因的质粒为阴性对照。5.16　引物序列见表1。表 1腺病毒 PCR扩增引物序列引物名称引物序列（5-3）扩增片段大小正向引物5-GCC GCA GTG GTC TTA CAT GCC ACA CTC-3;301 bp反向引物 5-CAG CAC GCC GCG GAT GTC AAA GT-3注：PCR引物核苷酸序列采用与Ad40及Ad41六邻体基因高度保守区互补引物扩增腺病毒DNA。6检测步骤6.1样品处理样品运输过程中保持温度在0℃～5℃。实验室接到样品后应尽快进行检测，如果暂时不能检测应将样品保存于一70℃冰箱中,避免样品的反复冻融。取可疑食品5g～10g加人40 mL匀浆缓冲液中，匀浆器充分匀浆 3 min;将匀浆液置于37℃空气浴振荡摇床中，200 r/min振荡 30 min;4℃，12000g，离心10min。取10mL上清液转移到10mL离心管中，加人1.4mLPEG8000溶液，颠倒5次