SN_T 4280.1-2015国境口岸红头丽蝇DNA条形码鉴定方法.pdf

S中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4280.1—2015国境口岸红头丽蝇DNA条形码鉴定方法DNA barcoding identification of Calliphora vicina Robineau-Desvoidy,1830 at the frontier port2016-01-01实施2015-05-26发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4280.1—2015前言本部分按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国河北出入境检验检疫局。本部分主要起草人：邱德义、岳巧云、张宪臣、刘德星、聂维忠、陈健、魏晓雅、吴可量、胡佳。1 SN/T 4280.12015国境口岸红头丽蝇DNA条形码鉴定方法1范围SN/T4280的本部分规定了红头丽蝇的DNA条形码鉴定程序和结果判定。本部分适用于对红头丽蝇的成虫（包括肢体不全的成虫），以及蛳、幼虫、卵等DNA条形码鉴定的工作。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1876医学媒介生物标本采集、制作及保存规程SN/T2752.4卫生检疫人员的自我防护规范第4部分：实验室人员WS/T230临床诊断中聚合酶链反应（PCR)技术的应用3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1红头丽蝇CalliphoravicinaRobineau-Desvoidy，1830丽蝇科，丽蝇属。因为腹部呈青色，俗名为“blueblowfly”或者“bluebottle”，因其颊部橙红色，所以中文名为红头丽蝇，为重要的媒介生物和法医昆虫。3.2DNA条形码DNAbarcode生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。DNA条形码已经成为物种鉴定的重要工具，在节肢动物尤其是昆虫中，一般是指线粒体COI(线粒体细胞色素C氧化酶亚基I)上的658bp的标准片段。3.3DNA条形码鉴定技术DNAbarcodingidentification technology一种利用DNA条形码基因片段进行生物物种鉴定和系统进化关系研究的技术，建立在基因扩增和序列比对的基础之上，它具有不受物种发育状态、性别及形态特征完整与否的限制、减少对形态分类专家的依赖、不受主观因素影响、准确率高、借助互联网可以实现数据共享等特点。3.4空白对照blankcontrol从基因组DNA提取步骤开始至PCR扩增和PCR产物检测整个过程，没有加入任何医学媒介昆虫组织的空白，与其他受试的昆虫平行进行操作以观察实验是否处于正常状态。空白对照应没有PCR产物条带产生。1 SN/T4280.1—20153.5阳性对照positivecontrol在PCR扩增过程中，与受试样品平行进行的，在正常反应情况下，一定能产生PCR产物的DNA为反应模板，用于观察整个反应体系和反应过程是否正常，阳性对照应有PCR产物带产生。3.6阴性对照negative control在PCR扩增过程中，与受试样品平行进行的，用ddHO代替模板DNA而进行的对照反应，用于观察整个反应体系是否正常，确认没有受到污染，阴性对照应没有PCR产物条带产生。3.7凭证标本voucherspecimen获取DNA条形码等分子数据的来源（母体）标本。凭证标本可以是不完整的标本，但与本标本的DNA条形码数据等分子凭证必须是一一对应的关系。凭证标本的保存非常重要，必须有唯一性标识如：标本编号、存放、鉴定以及采集等详细信息。3.8分子凭证molecularvoucher与凭证标本相对应的基因组DNA、PCR产物、DNA条形码序列及峰图，做克隆还应包括含DNA条形码片段的阳性转化子。分子凭证的保存非常重要，必须有唯一性的编号、存放等详细信息，以便于日后查证。4缩略语下列缩略语适用于本文件。BOLD：生物条形码数据系统（barcoding of life data system）注：网址：http：//5原理利用线粒体DNA中的COI基因的通用引物对受试样品基因组DNA进行扩增，PCR产物测序后，得到长度约为658bp（不包含引物的序列）的DNA片段，跟BOLD数据库进行比对，根据序列的相似度实现物种鉴定的目的。6引物LCO14905-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3HCO21985′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-37鉴定程序7.1准备实验室需具备的设备和试剂参见附录A，实验室生物安全应符合GB1948