NY_T 2470-2013小麦品种鉴定技术规程 SSR分子标记法.pdf

ICS 65.020.20B 05NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 2470—2013小麦品种鉴定技术规程SSR分子标记法Protocol for the identification of wheat varieties--SSR marker method2014-04-01实施2013-12-13 发布中华人民共和国农业部发布 NY/T 2470-—2013目次前言范围12规范性引用文件术语和定义34原理.仪器设备及试剂.56溶液配制1引物8操作程序9等位变异数据采集.10判定标准仪器设备及试剂附录A(规范性附录)溶液配制.附录B(规范性附录)核心引物.附录C(规范性附录)参照品种名单附录D(资料性附录) NY/T 2470--2013前言本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担别这些专利的责任。本标准由农业部种子管理局提出。本标准由全国植物新品种测试标准化技术委员会(SAC/TC277)归ⅡI。本标准起草单位：山东省农业科学院作物研究所、农业部科技发展中心。本标准主要起草人：李汝玉、张晗、王东建、孙加梅、姚风霞、郑永胜、许金芳、段丽丽、李华。I NY/T麦品种鉴定技术规程SSR分子标记法1范围本标准规定了利用简单重复序列（Simple sequcnccrepeats，SSR）分子标记进行普通小麦（TriticumaestivumI.）品种鉴定的试验方法、数据记录格式和判定标准。本标准适用于普通小麦DNA分子数据的采集和品种鉴定。.2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T3543.2农作物种子检验规程GB/T19557.2植物新品种特异性、致性和稳定性测试指南普通小麦3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1核心引物core primer多态性好、PCR扩增稳定的一套SSR引物。3. 2参照品种referencevariety对应于SSR位点上不同等位变异的一组品种。参照品种用于辅助确定待测样品等位变异的大小，校正仪器设备的系统误差。4原理SSR分布小麦基因组的不同位置上，不同品种每个位点上重复单位的数目及序列可能不同。由予每个简单重复序列两侧的序列是高度保守和单拷贝的，因而可根据其两侧的序列设计·-对特异引物，利用PCR技术对重复序列进行扩增，得到的PCR产物在电泳过程中的电场作用下，由于分子量大小不同得到分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记检测区分开。由于不同小麦品种遗传组成不同，所以，根据引物DNA序列存在差异或引物结合部位之间的DNA片段大小存在差异，即可鉴定小麦品种。5仪器设备及试剂仪器设备及试剂见附录A。6溶液配制相关溶液配制方法见附录B。7 引物引物相关信息见附录C。8操作程序8.1样品准备 NY/T 2470--2013种-子样品的分样和保存，应符合（GB/T3543.2的规定。每份样品检测10个个体（种子、叶片或其他等效物），混合分析。对-致性差的样品每个个体单独分析。8.2DNA提取8.2.1幼苗中DNA的提取将小麦种子发芽。取10株幼嫩组织约0.1g，剪碎，放入1.5mL离心管中。将DNA提取液预热到65℃，每管加人400uL，将样品研碎。将离心管置于65℃金属浴或水浴锅上，保温30min后取下。向离心管中加人400μl24：1（氯仿异戊醇）（V：V），振荡混匀，案温静置30min。10000g离心5min。将上清液200μl转人另只1.5ml.离心管，加人300μl一20℃预冷乙醇沉淀IDNA。10000g离心1min，弃上清液，加人500μL乙醇-乙酸氨溶液，6000g离心5min收集沉淀。加入100μLTE(pH8.0)溶液溶解IDNA，检测I)NA浓度。·20℃保存。8.2.2干种子中DNA的提取将10粒种子研碎，混合后称取约0.2g，放入离心管中，每管加人600μl预热到65℃的DNA提取液，置于65℃金属浴上。其余步骤同8.2.1。注：以上为推荐的IDNA提取方法。所获DNA质量能够符合PCR扩增需要的DNA提取方法都适用于本标准。8.3PCR扩增8.3.1参照品种的使用在进行PCR扩增和等位变异检测时，应间时包括相应的参照品种。不同位点的等位变异的参照品种的名称见附录C、参见附录D。同-·名称不同来源的参照品种的某-位点上的等位变异可能不相同，在使用前，应与原参照品种进行核对。对于附录C中未包括的等位变异，应按本标准的方法，通过使用DNA分析仪与参照品种同时进行检测确定其大小。注：多个品种在某-位点上可能都具有相同的等位变异。在确认这些品种某位点上等位变