SNT 1379.3-2006猪瘟中和免疫荧光试验操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1379.3—2006猪瘟中和免疫荧光试验操作规程Protocol of immuno-fluoresent neutralization test for classic swine fever2006-01-26 发布2006-08-16 实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局能购： SN/T 1379.3—2006前言SN/T1379共分为三个部分：猪瘟单克隆抗体酶联免疫吸附试验；猪瘟免疫荧光技术操作规程；猪瘟中和免疫荧光试验操作规程。本部分为SN/T1379的第3部分。本部分的附录 A为规范性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本部分主要起草人：董志珍、赵祥平、霍雷、蔡国瑞、姜红、王玉玲。本部分系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1379.3--2006猪瘟中和免疫荧光试验操作规程范围1SN/T1379的本部分规定了猪瘟免疫荧光抗体检测的技术要求。本部分适用于猪瘟病毒中和抗体水平的检测。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过SN/T1379的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3试剂和材料3. 1 试剂3.1.1实验用蒸馏水为GB/T6682中的三级水。3. 1.2 PK-15 细胞。3.1.3病毒：猪瘟（HC）Thiverval 弱毒冻干株。由指定单位提供，使用前用灭菌三级水溶解至规定容积。HC 阴性、阳性参照血清，由指定单位提供,试验前经56℃、30 min 灭活。3. 1HC三价荧光抗体工作液，由指定单位提供。3.1.6细胞稀释液：见第A.1章。3: 1.7细胞生长液：见第A.2章。3.1.8丙酮液（30℃保存）。3.1.9牛血清白蛋白(BSA)。3..1. 10细胞消化液：见第A.3章。3.2材料3.2.1超净工作台。3.2.2二氧化碳培养箱。3.2.31倒置荧光显微镜。3.2.4可调微量移液器及相应的滴头。3.2.596孔微量细胞培养板。3.2.6培养箱。3.2.7微量板振荡器。3.3被检血清3.3.1 无菌采取被检动物血液,分离血清。实验前将被检血清 56℃、30 min 灭活。3.3.2血清的运送和保存。需要冷藏方法运送和保存血清。 SN/T 1379.3--20064操作方法4.1 PK-15 细胞悬液的制备将细胞瓶中培养的3d～4 d的细胞。用细胞消化液进行消化，在显微镜下以细胞计数器计算细胞密度，而后以细胞营养液制成4×105个细胞/mL.的细胞悬液，置4℃备用。4. 2 病毒滴度的测定在微量细胞板（96孔）每孔加人50uL细胞培养液，用稀释液将冻存毒作10-1、10-²、·10-8系列稀释，每一稀释度病毒接种6孔，每孔50μL，正常细胞对照6孔不加病毒，仅加稀释液。而后每孔加100μL.PK-15细胞（4×105个细胞/mL），置37℃二氧化碳箱内培养72h收获，进行猪瘟荧光抗体染色（HC-FA)试验，并按Reed-Munch法计算，判读荧光组培半数感染量（TCIDsn）。4. 3HC-Thiverval 病毒工作液的制备以MEM稀释液稀释原毒成含200TCIDso的实验病毒工作量。4.4血清的稀释4.4.1用于筛选阴性猪群的定性试验，用稀释液将血清作 1：5稀释。4.4.2用于检测抗体的定量试验，用稀释液将血清作1：5的两倍连续稀释（1：5、1：10、1：20）。4.4.3用于进口检疫时，则根据双边协议的要求稀释血清。4.5中和试验4.5.1在96孔细胞培养板上，A排各孔加入80μL稀释液，其余各排每孔加人50L稀释液。4.5.2向A排各孔内加人20uL被检血清，每个样品加3孔，可作4个样品。4.5.3将被检血清混勾后吸出50μL至B排，依次倍比稀释到H排然后弃去50μL，即血清稀释依次为 1 :5、1:10、1: 20、1 : 40、1 : 80、1:160、1 :320、1: 6按测定的病毒滴度,将病毒稀释成50 μL中含 200TCIDs的工作毒。向 3孔之中 2孔加入50μL工作毒，另一孔加50 μL稀释液，作血清（细胞毒性)对照实验。盖上板盖，于微量振荡器上振荡2 s后,置湿盒内，放37℃二氧化碳箱中和1 h。4.5.5每孔加人100μL已制好的细胞悬液，置37℃二氧化碳箱内培养72h后收获。每天观察细胞的生长状况。4.5.6每批同时作病毒回归（工作毒及其10-1、10-²、10-3、10-*稀释物）及阴性、阳